人類腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控

人類腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控

腎間質(zhì)纖維是由于多種因素的影響，腎間質(zhì)細(xì)胞增多，基質(zhì)分解受抑制，纖維合成增加，導(dǎo)致大量外基質(zhì)細(xì)胞積聚，嚴(yán)重?fù)p害腎臟細(xì)胞，嚴(yán)重?fù)p害組織結(jié)構(gòu)，腎臟腎功能，最終導(dǎo)致腎功能和腎小管鈣化。這是所有慢性腎臟疾病發(fā)展的共同最終路徑。由于腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)在腎間質(zhì)纖維化變化中的重要性已經(jīng)為人們認(rèn)識(shí),所以積極探索有效的預(yù)防、抑制甚至逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生對(duì)治療腎間質(zhì)纖維化有重要意義。已有研究表明血小板源性生長因子(PDGF)家族在腎臟病的纖維化發(fā)展中起重要作用,通過抑制PDGF的表達(dá)能減輕腎纖維化材料和方法一、酶標(biāo)記的羊抗兔人類腎小管上皮細(xì)胞(HKC)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM\F12(Gibico公司,USA);0.25%胰蛋白酶(Thermo公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、胎牛血清(FBS)(北京中山公司);人重組TGF-β二、方法1.細(xì)胞培養(yǎng)和群體培養(yǎng)將HKC培養(yǎng)于DMEM\F12,5%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2.細(xì)胞無聚甲醛法測定各組HKCPDGF-BB及VEGF蛋白的表達(dá)。獲得細(xì)胞爬片后,以冷PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定20min后吸干,加入PBS水化。0.1%Tritonx-100室溫30min,0.3%H3.ctgackcacccggaa-3’下游按Trizol說明書提取細(xì)胞中的總RNA,紫外分光光度機(jī)對(duì)RNA定量,用Oligo(dT)引物進(jìn)行樣品RNA(200ng)的反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。α-SMA上游5’-GCTCACGGAGGCACCCCTGAA-3’下游5’-CTGAT-AGGACATTGTTGTTAGCAT-3’。PDGF-BB上游5’-AAGCATGTGCCGGAGAAGCG-3’下游5’-TC-CTCTAACCTCACCTGGAC-3’。VEGF上游5’-AC-CATGAACTTTCTGCTGTC-3’下游5’-TCACCGC-CTCGGCTTGTCAC-3’。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游5’-CAAGGTCATCCATGA-CAACTTTG-3’下游5’-GTCCACCACCCTGTTGCTG-TAG-3’。RT-PCR反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液2.5μl,MgCl三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS12.0軟件對(duì)結(jié)果中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用LSD檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、注意hkc形式的觀察倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),陰性對(duì)照組及阿利吉侖組的HKC在6孔細(xì)胞培養(yǎng)版中生長6d后,呈橢圓形的形態(tài)學(xué)特征。TGF-β二、免疫組化效果1.亞莉亞吉倫對(duì)pdgf-bb的影響陰性對(duì)照組和阿利吉侖組PDGF-BB陽性細(xì)胞占總HKC的面積比值均很低,2組之間無差異(P>0.05)。TGF-β2.阿里斯頓對(duì)vegf的影響陰性對(duì)照組VEGF陽性細(xì)胞占總HKC的面積比值4.925%,阿利吉侖組與陰性對(duì)照組無差異(P>0.05)。TGF-β三、各組pdgf-bbmrna表達(dá)比較陰性對(duì)照組有少量α-SMAmRNA表達(dá),單獨(dú)阿利吉侖作用24h后,較陰性對(duì)照組α-SMAmRNA表達(dá)量無顯著變化(P>0.05);TGF-β陰性對(duì)照組有少量PDGF-BBmRNA的表達(dá),單獨(dú)阿利吉侖作用24h后,較陰性對(duì)照組PDGF-BBmRNA表達(dá)量無顯著變化(P>0.05);TGF-β3.阿里斯頓對(duì)vegfm字體的影響陰性對(duì)照組及阿利吉侖組有微量VEGFmRNA的表達(dá),2組間無差異(P>0.05)。TGF-βmdd的臨床表現(xiàn)大量的基礎(chǔ)和臨床研究都證實(shí)了RAS系統(tǒng)活化在慢性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。RAS抑制劑可作用于三個(gè)位點(diǎn):抑制腎素活性、抑制ACE活性、阻斷AT在正常生理狀態(tài)下,腎小管細(xì)胞輕度損傷會(huì)導(dǎo)致PDGF分泌的增加,PDGF在完成腎臟細(xì)胞修復(fù)后會(huì)恢復(fù)正常水平,但如果致病因素持續(xù)存在則會(huì)導(dǎo)致PDGF的過度表達(dá),促進(jìn)成纖維細(xì)胞大量增殖,加速成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,分泌大量的Ⅰ、Ⅲ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)聚集,促進(jìn)腎纖維化,損傷腎功能。有研究表明,在發(fā)生腎間質(zhì)纖維化的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中P