細(xì)胞器蛋白的制備

細(xì)胞與細(xì)胞器蛋白質(zhì)制備細(xì)胞與細(xì)胞器蛋白質(zhì)提取蛋白質(zhì)純化細(xì)胞器蛋白的制備第1頁(yè)細(xì)胞及細(xì)胞器蛋白質(zhì)提取

意義：

在研究細(xì)胞時(shí)經(jīng)常要研究細(xì)胞不一樣組份，而研究得最多細(xì)胞組份就是細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞漿。分離細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞漿蛋白，不但能夠用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位，而且很多時(shí)候分離出來(lái)蛋白能夠用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面研究。

細(xì)胞器蛋白的制備第2頁(yè)細(xì)胞及細(xì)胞器蛋白質(zhì)提取1.細(xì)胞核蛋白質(zhì)提取2.線粒體及細(xì)胞漿蛋白質(zhì)提取3.全細(xì)胞蛋白質(zhì)提取細(xì)胞及細(xì)胞器蛋白提取

細(xì)胞器蛋白的制備第3頁(yè)1.細(xì)胞核蛋白質(zhì)提?。?）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)HeLa細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.6×106個(gè)細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)適當(dāng)初間；（2）收取細(xì)胞與培養(yǎng)液至離心桶中，4℃、3000rpm/min離心5分鐘，棄上清；（3）用1ml預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞沉淀，并將其移入預(yù)冷EP管，離心升至1rpm/min即停頓，棄上清；（4）細(xì)胞沉淀用homogenizationbuffer重懸；（5）使用Douncehomogenizer對(duì)細(xì)胞重懸液進(jìn)行homogenize，操作次數(shù)視細(xì)胞株與操作人而定；（6）4℃、1000/min離心5分鐘，棄上清，沉淀即為細(xì)胞核；（7）向細(xì)胞核沉淀中加入適量裂解液RIPA，充分混勻，冰上孵育1小時(shí)，每隔15分鐘混勻一次；（8）4℃、1rpm/min離心15分鐘，棄沉淀，將上清移入新預(yù)冷EP管；（9）取細(xì)胞核蛋白質(zhì)進(jìn)行BCA定量；（10）取等量細(xì)胞核蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS電泳分析。細(xì)胞器蛋白的制備第4頁(yè)2.線粒體及細(xì)胞漿蛋白質(zhì)提?。?）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)HeLa細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.6×106個(gè)細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)適當(dāng)初間；（2）收取細(xì)胞與培養(yǎng)液至離心桶中，4℃、3000rpm/min離心5分鐘，棄上清；（3）用1ml預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞沉淀，并將其移入預(yù)冷EP管，離心升至1rpm/min即停頓，棄上清；（4）向細(xì)胞沉淀中加入91μl/管MitochondriaIsolationKit試劑A（含蛋白酶抑制劑），中速旋渦震蕩5秒鐘，冰上孵育2分鐘；（5）接著加入10μl/管MitochondriaIsolationKit試劑B（含蛋白酶抑制劑），高速旋渦震蕩5秒鐘，冰上孵育5分鐘；（6）再加入100μl/管MitochondriaIsolationKit試劑C（含蛋白酶抑制劑），顛倒混勻，4℃、700g離心10分鐘，棄沉淀；細(xì)胞器蛋白的制備第5頁(yè)2.線粒體及細(xì)胞漿蛋白質(zhì)提?。?）將上清移入新預(yù)冷EP管，4℃、12,000g/min離心15分鐘，沉淀含線粒體，將上清移入另一新預(yù)冷EP管，再一次4℃、12,000g/min離心60分鐘或4℃、100,000g/min離心15分鐘，上清即含胞漿蛋白質(zhì)；（8）向含線粒體沉淀中加入60l/管MitochondriaIsolationKit試劑C（含蛋白酶抑制劑），混勻清洗沉淀，4℃、12,000g離心10分鐘，棄上清；（9）向沉淀中加入適量細(xì)胞裂解液RIPA，充分混勻，冰上孵育1小時(shí)，每隔15分鐘混勻一次；（10）4℃、1rpm/min離心15分鐘，棄沉淀，將上清（即含線粒體提取物蛋白質(zhì)）移入新預(yù)冷EP管；（11）取胞漿蛋白質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行BCA定量；（12）取等量蛋白質(zhì)胞漿和線粒體樣品進(jìn)行SDS電泳。細(xì)胞器蛋白的制備第6頁(yè)3.全細(xì)胞蛋白質(zhì)提?。?）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)HeLa細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1.6×106個(gè)細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)適當(dāng)初間；（2）收取細(xì)胞與培養(yǎng)液至離心桶中，4℃、3000rpm/min離心5分鐘，棄上清；（3）用1ml預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞沉淀，并將其移入預(yù)冷EP管，離心升至1rpm/min即停頓，棄上清；（4）向細(xì)胞沉淀中加入適量細(xì)胞裂解液RIPA或IP，充分混勻，冰上孵育1小時(shí)，每隔15分鐘混勻一次；（5）4℃，1r/min離心15分鐘，上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，采取BCA蛋白定量試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度留待其它試驗(yàn)。細(xì)胞器蛋白的制備第7頁(yè)注意事項(xiàng)1.抽提蛋白全部步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。2.全部試劑及器具均需預(yù)冷后使用，以確保蛋白質(zhì)完整性及活性。細(xì)胞器蛋白的制備第8頁(yè)蛋白質(zhì)純化意義：

伴隨分子生物學(xué)發(fā)展，越來(lái)越多科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)各種試驗(yàn)技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表示變得越來(lái)越輕易。但分子生物學(xué)上游工作往往并非最終目標(biāo)，分子克隆與表示往往是要拿到純表示產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療生物制品。細(xì)胞器蛋白的制備第9頁(yè)蛋白質(zhì)純化普通標(biāo)準(zhǔn)主要將目標(biāo)蛋白和其它細(xì)胞成份如DNA、RNA等分開(kāi)，因?yàn)榇藭r(shí)樣本體積大、成份雜、要求所用樹(shù)脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬，并能夠快速將蛋白與污染物分開(kāi)，預(yù)防目標(biāo)蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高分辨率，此階段是要把目標(biāo)蛋白與那些大小及理化性質(zhì)靠近蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小樹(shù)脂顆粒以提升分辨率，慣用離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂選擇性和柱效兩個(gè)原因。蛋白純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化兩個(gè)階段。粗分離階段精細(xì)純化階段細(xì)胞器蛋白的制備第10頁(yè)選擇性指樹(shù)脂與目標(biāo)蛋白結(jié)合特異性。柱效則是指各蛋白成份逐一從樹(shù)脂上集中洗脫能力，洗脫峰越窄，柱效越好。細(xì)胞器蛋白的制備第11頁(yè)各種蛋白純化方法及其優(yōu)缺點(diǎn)離子交換色譜親和層析排阻層析疏水作用層析電泳細(xì)胞器蛋白的制備第12頁(yè)離子交換色譜原理：

離子交換層析(IEC)是以離子交換劑為固定相，以含特定離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑上可交換離子與溶液中離子發(fā)生交換作用，因?yàn)椴灰粯尤苜|(zhì)離子與離子交換劑上離子化基團(tuán)親和力和結(jié)合條件不一樣，洗脫液流過(guò)時(shí)，樣品中離子按結(jié)協(xié)力弱強(qiáng)先后洗脫,而將混合物中不一樣離子進(jìn)行分離技術(shù)。細(xì)胞器蛋白的制備第13頁(yè)離子交換色譜原理：

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不一樣pH環(huán)境中所帶總電荷不一樣。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6-8）下帶負(fù)電荷。需用陰離子交換柱純化，極端pH下蛋白會(huì)變形失活，應(yīng)盡可能防止。因?yàn)樵谀硞€(gè)特定pH下不一樣蛋白所帶電荷數(shù)不一樣，與樹(shù)脂結(jié)協(xié)力也不一樣，伴隨緩沖液中鹽濃度增加或pH改變，蛋白按結(jié)協(xié)力強(qiáng)弱被依次洗脫。細(xì)胞器蛋白的制備第14頁(yè)離子交換色譜細(xì)胞器蛋白的制備第15頁(yè)離子交換色譜優(yōu)點(diǎn)離子交換特異性好

樹(shù)脂也比較廉價(jià)

缺點(diǎn)僅用離子交換單一方法得不到純蛋白，還需要其它純化步驟。細(xì)胞器蛋白的制備第16頁(yè)親和層析親和層析是一個(gè)層析技術(shù)，經(jīng)過(guò)生物分子之間特異性相互作用分離生物分子.原理：填料上配基與生物大分子特異結(jié)合，用特殊洗脫條件把被吸附生物分子洗脫下來(lái)。一個(gè)親和色譜填料只能用于一個(gè)或有限一類(lèi)生物分子。目標(biāo)蛋白與固相化配基特異結(jié)合而滯留，其它雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。細(xì)胞器蛋白的制備第17頁(yè)細(xì)胞器蛋白的制備第18頁(yè)親和層析優(yōu)點(diǎn)：

親和層析是最有效生物活性物質(zhì)純化方法，它對(duì)生物分子選擇性吸附和分離，能夠取得很高純化倍數(shù)。另外蛋白在純化過(guò)程中得到濃縮，結(jié)合到親和配基后，性質(zhì)愈加穩(wěn)定，其結(jié)果提升了活性回收率。另外它能夠降低純化步驟，縮短純化時(shí)間，對(duì)不穩(wěn)定蛋白純化十分有利。細(xì)胞器蛋白的制備第19頁(yè)疏水作用層析原理：

疏水作用層析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）是依據(jù)分子表面疏水性差異來(lái)分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子一個(gè)較為慣用方法。蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子表面經(jīng)常暴露著一些疏水性基團(tuán)，我們把這些疏水性基團(tuán)稱(chēng)為疏水補(bǔ)丁，疏水補(bǔ)丁能夠與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。不一樣分子因?yàn)槭杷圆灰粯?，它們與疏水性層析介質(zhì)之間疏水性作用力強(qiáng)弱不一樣，疏水作用層析就是依據(jù)這一原理分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子。細(xì)胞器蛋白的制備第20頁(yè)疏水作用層析疏水作用層析基本原理如圖所表示：細(xì)胞器蛋白的制備第21頁(yè)排阻層析凝膠是一類(lèi)多孔性高分子聚合物，每個(gè)顆粒如同一個(gè)篩子。當(dāng)樣品溶液經(jīng)過(guò)凝膠柱時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大物質(zhì)沿著凝膠顆粒間孔隙，伴隨溶劑流動(dòng)，首先流出層析柱；相對(duì)分子質(zhì)量較小物質(zhì)可自由地進(jìn)出凝膠顆粒網(wǎng)孔，使流量增加，移動(dòng)速率慢而最終流出層析柱。中等大小分子在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這么，經(jīng)過(guò)層析柱，混合物中各物質(zhì)按其分子大小不一樣而被分離。帶網(wǎng)孔葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出細(xì)胞器蛋白的制備第22頁(yè)排阻層析優(yōu)點(diǎn)純化蛋白分子量范圍寬，TosohBiosep企業(yè)聚合物樹(shù)脂，排阻極限可達(dá)00kD

樹(shù)脂微孔形狀適合分離球形蛋白質(zhì)，純化過(guò)程中也不需要能引發(fā)蛋白變性有機(jī)溶劑。

缺點(diǎn)一些蛋白不適適用凝膠過(guò)濾純化，電荷密度較高蛋白輕易吸附在上面樹(shù)脂本身也比較昂貴細(xì)胞器蛋白的制備第23頁(yè)電泳