十二核酸的生物合成專家講座

第十二章核酸生物合成十二核酸的生物合成專家講座第1頁

主要內(nèi)容一

DNA生物合成二

RNA生物合成十二核酸的生物合成專家講座第2頁中心法則

（centraldogma）

復制：是親代雙鏈DNA按堿基配對標準，準確形成兩個相同核苷酸序列子代DNA分子過程。兩條DNA鏈都可作為復制模板。

轉(zhuǎn)錄：是以一條DNA鏈為模板，將DNA鏈上儲存遺傳信息按堿基配對標準準確轉(zhuǎn)換成互補mRNA過程。

翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列過程。

中心法則：遺傳信息由DNAmRNAPro流動路徑。

十二核酸的生物合成專家講座第3頁蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復制復制DNARNA中心法則：遺傳信息由DNAmRNAPro流動路徑。補充和完善之處：A：RNA作為遺傳物質(zhì)能自我復制，并作為mRNA指導Pro合成。B：RNA能以逆轉(zhuǎn)錄方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。十二核酸的生物合成專家講座第4頁十二核酸的生物合成專家講座第5頁十二核酸的生物合成專家講座第6頁

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶催化下按堿基互補標準合成兩條與模板鏈互補新鏈，以組成新DNA分子。這么新形成兩個DNA分子與親代DNA分子堿基次序完全一樣。因為子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成，這種復制方式稱為半保留復制。一、

DNA生物合成

（一）半保留復制

十二核酸的生物合成專家講座第7頁

[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標識加密度梯度離心技術試驗,證實了DNA是采取半保留方式進行復制.DNA半保留復制試驗依據(jù)十二核酸的生物合成專家講座第8頁

Meselson-stahl試驗（a）密度梯度離心DNA帶（b）對應于左側DNA帶解釋十二核酸的生物合成專家講座第9頁（二）DNA復制起點和方向

復制叉（replicationforks）

：復制中DNA分子，未復制部分是親代雙螺旋，而復制好部分是分開，由兩個子代雙螺旋組成，復制正在進行部分叫做復制叉。細胞內(nèi)存在著能識別起始點特種Pr。

十二核酸的生物合成專家講座第10頁

方向：復制叉從起始點出發(fā)，沿DNA移動，移動方向與前導鏈延長方向相同。復制可能是單向，也可能是雙向，兩個方向復制速度不一定相同。大多數(shù)是雙向。

眼狀結構：線狀DNA分子上正在復制部分形成；

θ結構：環(huán)狀DNA分子上正在復制部分形成。

十二核酸的生物合成專家講座第11頁DNA雙向和單向復制環(huán)狀

DNA復制時所形成Q結構起始點復制叉推進復制叉起始點起始點起始點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制十二核酸的生物合成專家講座第12頁兩種復制模式（a）單向復制模式（b）大腸桿菌染色體DNA雙向復制模式十二核酸的生物合成專家講座第13頁單向復制i雙向復制觀察到放射自顯影圖象十二核酸的生物合成專家講座第14頁18%質(zhì)粒ColE1單向復制示意圖單向復制十二核酸的生物合成專家講座第15頁最早研究DNA復制起點和方向是J.Cairns（1963年）。θ型十二核酸的生物合成專家講座第16頁DNAReplication十二核酸的生物合成專家講座第17頁原核生物：只有一個復制原點。第二次復制可在第一次復制完成之前開始復制。真核生物；可在DNA鏈上多個不一樣位點同時起始復制。

所以真核生物DNA復制速度比原核生物快些。

十二核酸的生物合成專家講座第18頁真核生物DNA多起點復制十二核酸的生物合成專家講座第19頁（三）DNA復制過程（原核生物）

DNA合成是以四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP為前體，在DNA聚合酶催化下，向DNA3′—OH端添加脫氧核苷酸，在DNA3′—OH與添加脫氧核苷酸5′—磷?；g形成3，5—磷酸二酯鍵，反應中脫去一個焦磷酸基團。

合成方向：5′3′

十二核酸的生物合成專家講座第20頁添加到鏈上每個核苷三磷酸是按照模板鏈次序由堿基互補配對標準選擇。

反應通式可寫為：（NMP）n—3′—OH＋dNTP

（NMP）n＋1—3′—OH＋PPi

十二核酸的生物合成專家講座第21頁1、DNA聚合酶ⅠpolⅠ

(1)具5′3′聚合酶活性將脫氧核糖核苷三磷酸dNTP逐一添加到含有3′—OH末端多核苷酸鏈上形成3，5—磷酸二酯鍵。

特點：A：底物為dNTP；B：DNA模板(3′5′)；C：引物：RNA引物（帶3′—羥基）；D：方向5′3′；F：產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。十二核酸的生物合成專家講座第22頁DNA聚合酶催化鏈延長反應5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈十二核酸的生物合成專家講座第23頁

(2)含有3′5′端核酸外切酶活性

有校對功效，能在3′—OH端將DNA鏈水解。以確保DNA復制真實性。

十二核酸的生物合成專家講座第24頁DNA聚合酶3′-5′外切酶水解位點3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點十二核酸的生物合成專家講座第25頁(3)含有5′3′端核酸外切酶活性由5′端水解DNA鏈，主要是切去一小段DNA，包含RNA引物和損傷DNA部分。

polⅠ主要功效：用于修復DNA雙螺旋區(qū)中單鏈區(qū)，這些單鏈區(qū)是在DNA復制時或DNA受損傷后留下?；钚愿摺?/p>

十二核酸的生物合成專家講座第26頁DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點單鏈缺口5′十二核酸的生物合成專家講座第27頁2、DNA聚合酶ⅡpolⅡ

含有3′5′端核酸外切酶活性，主要負責DNA修復，在一定程度上參加DNA復制?；钚缘汀９πР皇智宄?，是一個修復酶。

十二核酸的生物合成專家講座第28頁3、DNA聚合酶ⅢpolⅢ是使DNA鏈延長主要聚合酶，當前已知全酶是由7種多肽形成復合物，含有10種共22個亞基組分（α2ε2θ2ζ2г2δ2δ2′2χ2ψ2β2）和Zn原子。十二核酸的生物合成專家講座第29頁大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶結構和功效

延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體關鍵酶校對引物結合和識別促使關鍵酶二聚化十二核酸的生物合成專家講座第30頁（1）α亞基：具5′

3′端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）ε亞基具3′

5′端核酸外切酶活性。校對作用，以提升保真性；（3）α、ε、θ亞基相連形成關鍵酶polⅢ，θ亞基起組建作用；（4）關鍵酶+ζ亞基后成為二聚體，稱為polⅢ′；（5）polⅢ′與γ、δ亞基結合，形成polⅢ′，γ、δ亞基可增強酶與模板結合；（6）polⅢ′′與β亞基結合形成全酶，β亞基如同夾子，夾住DNA向前滑動，不脫離，提升連續(xù)合成能力。

十二核酸的生物合成專家講座第31頁大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞分子統(tǒng)計數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較項目DNA聚合酶III切除引物修復修復復制功效

1999年發(fā)覺聚合酶

和

，它們包括DNA錯誤傾向修復（erroounerepair）十二核酸的生物合成專家講座第32頁polⅠ不是DNA復制酶，理由：A、該酶合成DNA速度太慢，只是細胞內(nèi)DNA復制速度1%；B、連續(xù)合成能力較低，而細胞內(nèi)DNA復制不會頻繁中止；C、許多基因突變都會影響DNA復制，但都與polⅠ無關。

十二核酸的生物合成專家講座第33頁

3、雙鏈DNA復制分子機制（1）岡崎片段和半不連續(xù)復制不連續(xù)復制：3’→5’走向DNA實際上是由許多5’→3’方向合成DNA片段連接起來。（已知DNA聚合酶合成方向都是5’→3’）十二核酸的生物合成專家講座第34頁在一個復制叉內(nèi)兩條鏈復制方向、合成方式、復制速度是不一樣。

前導鏈（leadingstrand)：以一條鏈（3’→

5’）為模板時，子代鏈合成方向是5’→3’，合成是連續(xù)，合成速度較快。

十二核酸的生物合成專家講座第35頁后隨鏈(laggingstrand):以另一條親代鏈（5’→

3’）為模板時，子代鏈合成方向不能按照3’→5’方向進行，因為迄今沒有發(fā)覺這么DNA聚合酶，所以只能合成方向為5’→

3’方向許多DNA小片段（約1000--------dp，7-----10S），為1968年日本人岡崎等人發(fā)覺，叫岡崎片段，然后在DNA連接酶催化下，連接起來形成一條子代鏈。合成是不連續(xù)，合成速度較慢。當一段新岡崎片段合成后，polⅠ行使5’→3’核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作為替換，缺口由DAN連接酶封口。

十二核酸的生物合成專家講座第36頁(2)岡崎片段RNA引物引物合成由引物合成酶催化完成，這些酶在模板單鏈DNA上識別特殊序列，合成RNA引物。它本身沒有活性，需要與“引發(fā)前體”結合在一起，形成“引發(fā)體”后才有活性。引發(fā)體在復制叉上移動，識別合成起始點，引發(fā)RNA引物合成，該過程需ATP提供能量。十二核酸的生物合成專家講座第37頁方向：以DNA為模板，5’→3’長度：幾個至10個核苷酸，5′端含3個磷酸殘基，3′端為游離羥基。DNA聚合酶III

：聚合脫氧核糖核苷酸引物消除和缺口填補：DNA聚合酶IDNA連接酶：將岡崎片段連成長鏈十二核酸的生物合成專家講座第38頁為何需要RNA引物、而且最終要切除？1、DNA聚合酶有校正功效，每引入一個核苷酸都要復查一次，無誤后方繼續(xù)下去，它不能從無到有合成新鏈，因為在未核實前一個核苷酸處于正確配對狀態(tài)時是不會進行聚合反應；2、RNA引物是從新開始合成，錯配可能性大，在完成引物功效后即將它刪除，而代之以高保真DNA鏈。

十二核酸的生物合成專家講座第39頁解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物十二核酸的生物合成專家講座第40頁十二核酸的生物合成專家講座第41頁（3）DNA連接酶催化子代雙鏈DNA中切口處相鄰3’-OH和5’-磷酰基之間形成磷酸二酯鍵。但不能將兩條游離DNA單鏈連接起來。同時該酶要求含有3’-OH和5’-磷?；鵇NA片段能以氫鍵與互補鏈結合。

DNA—3′—OH＋P—5′—DNA＋ATP（NAD+）

DNA—3′—O—P—5′—DNA＋AMP＋PPi（NMN）

十二核酸的生物合成專家講座第42頁

E,coli連接酶催化下連接機制十二核酸的生物合成專家講座第43頁連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈十二核酸的生物合成專家講座第44頁（4）母本DNA雙鏈分離解螺旋酶（helicase）使DNA雙螺旋兩條鏈分開。條件：ATP提供能量，有單鏈DNA存在。后隨鏈：解旋酶結合于它模板上，移動方向是5′3′前導鏈：另一個解旋酶叫rep蛋白，移動方向是3′5′。

十二核酸的生物合成專家講座第45頁單鏈結合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）結合在單鏈DNA分子上，功效是穩(wěn)定已被解開DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。

十二核酸的生物合成專家講座第46頁拓撲異構酶（DNA松弛酶）（topoisomerase）包括超螺旋松弛，復制后又包括到它們再次形成。

正超螺旋（左）：雙螺旋DNA處于擰緊狀態(tài)時形成超螺旋，使DNA解開雙螺旋困難負超螺旋（右）：雙螺旋DNA處于擰松狀態(tài)時形成超螺旋。十二核酸的生物合成專家講座第47頁拓撲異構酶對DNA超螺旋進行準確調(diào)整，從而在DNA重組修復和DNA其它轉(zhuǎn)變中起作用。分為兩類：1、拓撲異構酶Ⅰ：可瞬時打開雙螺旋一條鏈，然后再連接。不需能量，同轉(zhuǎn)錄相關。2、拓撲異構酶Ⅱ；使DNA雙鏈同時斷裂，然后再連接。需能量ATP，同復制相關。

拓撲異構酶Ⅰ可除去負超螺旋，拓撲異構酶Ⅱ可引入負超螺旋，消除復制前產(chǎn)生正超螺旋，協(xié)同作用控制DNA拓撲結構，有利于DNA解開雙螺旋。十二核酸的生物合成專家講座第48頁參加大腸桿菌染色體DNA復制主要PrDNA旋轉(zhuǎn)酶→引入（或松解）DNA解鏈酶→使雙螺旋DNA解鏈單鏈結合蛋白→穩(wěn)定單鏈區(qū)引物合成酶→合成RNA引物DNA聚合酶III全酶→合成DNADNA聚合酶I→除去引物并填滿缺口DNA連接酶→連接DNA片段末端十二核酸的生物合成專家講座第49頁（5）DNA聚合酶“校對”作用DNA聚合酶含有三種不一樣酶活性。3’→5’外切酶活性是校對新生DNA鏈和更正聚合酶活性所造成“錯配”一個伎倆?，F(xiàn)在所發(fā)覺真核生物DNA聚合酶普通沒有校正功效。十二核酸的生物合成專家講座第50頁DNA聚合酶校對功效聚合酶錯配堿基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸十二核酸的生物合成專家講座第51頁（四）真核細胞DNA復制不十分清楚，與原核生物DNA復制比較：

（一）一致：1、基本機制相同。如半保留復制、半不連續(xù)復制。2、所需酶相同。十二核酸的生物合成專家講座第52頁（二）區(qū)分

真核生物

原核生物復制起始點

多個

一個復制方向

雙向

單向復制速度

較快

較慢起始點是否連續(xù)復制

不

是催化DNA鏈延長酶

兩種酶（polα、δ）

一個酶（polⅢ）引物酶結合情況

與DNA聚合酶

與解旋酶十二核酸的生物合成專家講座第53頁DNA聚合酶αβγδε定位細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核亞基數(shù)目412最少2>1外切酶活性無無3’→5’3’→5’3’→5’引物合成酶活性有無無無無功效復制過程中合成后隨鏈參加核DNA修復線粒體DNA復制催化前導鏈合成參加DNA修復十二核酸的生物合成專家講座第54頁端粒復制（1）半保留復制（2）可朝一個方向或兩個方向進行復制（3）DNA兩條鏈都從5’→3’（4）復制是半不連續(xù)，前導鏈連續(xù)，后隨鏈不連續(xù)合成（5）合成始于一小段RNA引物（6）復制有各種機制十二核酸的生物合成專家講座第55頁（五）反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導DNA合成）指以RNA為模板合成DNA過程。

最先在病毒中發(fā)覺這種酶，現(xiàn)在發(fā)覺存在于哺乳動物胚胎和正在分裂細胞中。

十二核酸的生物合成專家講座第56頁條件1、反轉(zhuǎn)錄酶：是一個多功效酶，具以下特征：（1）以RNA為模板合成DNA；（2）水解RNA，具3’→5’和5’→3’外切酶活性；（3）以DNA為模板合成DNA。2、前體物質(zhì)：dNTP3、引物：短鏈RNA或DNA

適當濃度Mg2＋、Mn2＋4、方向：5’→3’十二核酸的生物合成專家講座第57頁過程1、以親代RNA為模板合成一條與RNA互補DNA鏈（cDNA），形成RNA—DNA雜交分子。2、由核糖核酸酶H水解RNA—DNA雜交分子中RNA鏈；3、以剛合成DNA鏈為模板合成一條互補DNA鏈，形成DNA—DNA分子；4、DNA—DNA去向（1）整合到宿主細胞DNA分子中，但不表示；（2）DNA—DNA再轉(zhuǎn)錄合成RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)，生成子代RNA病毒。十二核酸的生物合成專家講座第58頁反轉(zhuǎn)錄過程中cDNA合成

依賴RNADNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNADNA聚合酶十二核酸的生物合成專家講座第59頁十二核酸的生物合成專家講座第60頁突變基因組DNA堿基次序發(fā)生突然而永久性改變。

1、點突變：指一個或幾個堿基對被置換。有兩種形式：轉(zhuǎn)換：一個嘌呤堿基或一個嘧啶堿基轉(zhuǎn)換為另一個嘌呤或嘧啶堿基。如TA被CG替換。顛換：嘌呤堿基變成嘧啶堿基或嘧啶堿基變成嘌呤堿基。如TA被AT替換。2、結構畸變DNA大段堿基發(fā)生改變。包含：插入、缺失、倒位、易位。

（六）DNA損傷與修復十二核酸的生物合成專家講座第61頁

DNA突變類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基正確置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT十二核酸的生物合成專家講座第62頁造成DNA損傷原因可能是生物原因、物理原因或是化學原因；可能來自細胞內(nèi)部，也可能來自細胞外部；受到破壞可能是DNA堿基、糖基或是磷酸二酯鍵。物理誘變劑：如紫外線、X射線等。生物誘變劑：如噬菌體、抗菌素等?；瘜W誘變劑：直接作用于DNA模板誘變劑，