外植體的接種和培養(yǎng)

第一節(jié)

外植體接種

一．接種室和凈化工作臺消毒

二．外植體接種

外植體的接種和培養(yǎng)第1頁一．接種室和凈化工作臺消毒1．紫外燈照射20分鐘；2．70%酒精噴霧空氣；3．臺面酒精棉球擦洗；外植體的接種和培養(yǎng)第2頁二．外植體接種1．接種工具要經(jīng)常在酒精燈上燒，預防交叉感染；2．燒后接種工具要放冷卻后才能用；3．操作不能離超凈臺邊緣太近，也不能太遠；4．外植體應按照要求在培養(yǎng)基表面或內(nèi)部放好，不能讓其在器皿中活動；5．包扎器皿應在操作臺面上進行，動作要輕，包扎好后才能從臺面上移走。6．接種時禁止談話，預防咳嗽。外植體的接種和培養(yǎng)第3頁第二節(jié)

培養(yǎng)方法

一．固體培養(yǎng)

二．液體培養(yǎng)

外植體的接種和培養(yǎng)第4頁一．固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)最慣用凝固劑是瓊脂，使用濃度為0.6-1.0%（重量/體積）。固體培養(yǎng)最大優(yōu)點是簡單、方便。但缺點是1）只有外植體底部表面才能接觸培養(yǎng)基，吸收營養(yǎng)，上面則不能，影響生長速度；2）外植體插入培養(yǎng)基后，氣體交換不暢，排泄有害物質(zhì)積累，造成毒害；3）組織受光不均勻，細胞群生長不一致。

外植體的接種和培養(yǎng)第5頁二．液體培養(yǎng)靜止濾紙橋培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)。

外植體的接種和培養(yǎng)第6頁靜止濾紙橋培養(yǎng)

這種方法主要用于胚培養(yǎng)和愈傷組織培養(yǎng)等，當前此法不很普遍。外植體的接種和培養(yǎng)第7頁震蕩培養(yǎng)

往復式搖床自旋式培養(yǎng)架外植體的接種和培養(yǎng)第8頁第三節(jié)

培養(yǎng)條件

一．溫度

二．光照

三．培養(yǎng)基pH四．濕度

五．氧和其它氣體

外植體的接種和培養(yǎng)第9頁一．溫度普通溫度在25±2℃。通常低于15℃時，外植體生長出現(xiàn)停滯，但高于35℃對生長又不利。在促進芽發(fā)生時溫度可略低一些。

外植體的接種和培養(yǎng)第10頁二．光照光照是組織培養(yǎng)中主要外界條件之一，它對外植體生長和分化有很大影響，表現(xiàn)在光照、光質(zhì)和光周期等方面。

外植體的接種和培養(yǎng)第11頁1.光照有材料適合光培養(yǎng)，有則適合暗培養(yǎng)，如玉簪花芽和花莖培養(yǎng)。在暗培養(yǎng)條件下芽愈傷組織誘導率較光照條件下要高，而花莖只有在暗培養(yǎng)條件下才能誘導出愈傷組織。有一些植物（荷蘭芹）組織培養(yǎng)其器官形成不需要光，而有些植物則光可提升幼苗分化率。普通來說，愈傷組織誘導不需要光或需較少光。

外植體的接種和培養(yǎng)第12頁2.光質(zhì)光質(zhì)也能顯著影響外植體愈傷組織誘導、組織增殖及器官分化。如對楊樹愈傷組織生長，紅光有促進作用，藍光則有妨礙作用。在百合株芽增殖和分化時發(fā)覺，在紅光下8周后不但產(chǎn)生愈傷組織，同時也直接分化出苗，11周后所產(chǎn)生愈傷組織也分化成苗；而在藍光下12周后才出現(xiàn)愈傷組織；白光下則為未見愈傷組織形成，可見紅光能促進生長和分化。不一樣植物對光要求不一樣，需不停積累和試驗才能掌握不一樣植物培養(yǎng)規(guī)律。在普通組織培養(yǎng)生產(chǎn)中，往往忽略光質(zhì)影響。

外植體的接種和培養(yǎng)第13頁3.光周期光周期對試管苗增殖和分化影響，通常都選取一定光周期來進行外植體組織培養(yǎng)，如普通都選取16h光照、8h黑暗。這在組織培養(yǎng)前應搞清該植物對光周期是否敏感。我們試驗室主要采取12h光照和12h黑暗。外植體的接種和培養(yǎng)第14頁三．培養(yǎng)基pH通常普通培養(yǎng)基pH值都在5.6~6.0之間。如pH值不適則直接影響外植體對營養(yǎng)物質(zhì)吸收，進而影響外植體脫分化、增殖和器官形成。不一樣植物對pH要求不一樣，如蘭花要求pH值5.2或更低一些，而玉米胚乳組織培養(yǎng)在7.0時愈傷組織鮮重最快。

外植體的接種和培養(yǎng)第15頁四．濕度組織培養(yǎng)中濕度影響有兩方面：一是培養(yǎng)容器內(nèi)濕度，它濕度條件可常保持在100%；二是培養(yǎng)室濕度，它濕度改變較大。濕度過高或過低都不利于組織培養(yǎng)。

外植體的接種和培養(yǎng)第16頁五．氧和其它氣體

氧是植物組織培養(yǎng)必需。在接種時應防止把整個外植體全部埋在瓊脂中，以免造成缺氧。培養(yǎng)瓶蓋需要一定透氣性。培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物釋放微量乙烯和高濃度二氧化碳有時會有利于培養(yǎng)物生長，但更多是妨礙甚至是毒害培養(yǎng)物。外植體的接種和培養(yǎng)第17頁第四節(jié)

外植體褐變及預防在組織培養(yǎng)中，常見到外植體因為褐變（browning），產(chǎn)生致死性褐化物，不但使培養(yǎng)基變褐，而且造成培養(yǎng)失敗，它已經(jīng)成為組織培養(yǎng)中一個棘手問題，同時也成為植物快繁體系建立一大障礙。能夠說褐變、菌類污染、和過分含水（玻璃化）是組織培養(yǎng)中三大難題，尤其是褐變。

外植體的接種和培養(yǎng)第18頁蝴蝶蘭試管苗增殖過程中褐化現(xiàn)象外植體的接種和培養(yǎng)第19頁一．褐變原因

很多植物尤其是木本植物體內(nèi)含有較多酚類化合物。在完整植株體細胞內(nèi)，酚類化合物與多酚氧化酶分隔存在，所以比較穩(wěn)定。當切割外植體后，切割附近細胞分隔效應被打破，酚類化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶便氧化酚類化合物而成為褐色醌類物質(zhì)和水。醌類又會在酪氨酸酶等酶作用下，使外植體蛋白質(zhì)聚合，生長停滯，最終造成死亡。外植體的接種和培養(yǎng)第20頁二．影響褐變原因及預防辦法

1．基因型：木本植物較草本植物易褐變。2．外植體生理狀態(tài)：普通來說伴隨年紀和組織木質(zhì)化程度增加而褐變加強。3．外植體培養(yǎng)條件：取材料之前進行遮光處理再切取外植體，則褐變降低，暗培養(yǎng)或低光照能減輕褐變。另外較低溫度下培養(yǎng)也可適當降低褐變。4．培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)能有效降低褐變；初代培養(yǎng)時降低無機鹽濃度可降低褐變；6-BA增加褐變，2.4-D和NAA降低褐變；加入抗氧化劑（硫代硫酸鈉、抗壞血酸、蘇糖二硫醇等）可降低褐變；加入吸附劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可減輕褐變。

外植體的接種和培養(yǎng)第21頁第五節(jié)試管苗玻璃化現(xiàn)象及其預防辦法

自從1981年Debergh等明確提出試植物“玻璃化”（vitrification）概念以來，發(fā)覺在很多木本和草本試管植物中都存在玻璃化現(xiàn)象。關于植物組織培養(yǎng)中玻璃苗成因和預防方法研究已經(jīng)引發(fā)了人們廣泛注意，成為試管苗工廠化生產(chǎn)中亟待處理一個問題。

外植體的接種和培養(yǎng)第22頁香石竹玻璃化試管苗外植體的接種和培養(yǎng)第23頁一．玻璃苗形態(tài)解剖與生理特點1.玻璃苗是植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)半透明狀、畸形試管植物，不能夠移栽成活。2.玻璃苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸狀，植株矮小、腫脹，失綠，葉片皺縮呈縱向卷曲，脆弱易碎；3.葉表皮缺乏角質(zhì)層蠟質(zhì)，無功效性氣孔，不含有柵欄組織，僅有海綿組織；4.體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素含量低；5.組織畸形，吸收和光合作用功效不全，分化能力低，難以繼代、擴大繁殖；6.生根困難，難移栽成活。外植體的接種和培養(yǎng)第24頁二．玻璃苗發(fā)生原因

1.玻璃化不一樣部位節(jié)段外植體也與玻璃化相關?？赡芘c培養(yǎng)基滲透勢不妥相關；2.培養(yǎng)基中激素也和玻璃化呈正相關；3.培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體和外界交換不暢與玻璃化有一定關系；4.高銨態(tài)氮也是造成玻璃化原因之一；5.不一樣部位節(jié)段外植體也與玻璃化相關。

外植體的接種和培養(yǎng)第25頁三．玻璃苗發(fā)生機理

外植體的接種和培養(yǎng)第26頁相關試管苗玻璃化機理到當前為止仍未得出一致得看法。1．張洪勝認為乙烯對玻璃苗形成起開啟作用；但張昆瑜等在香石竹培養(yǎng)基中添加ACC和乙烯利（乙烯釋放劑）則有利于蛋白質(zhì)合成和干物質(zhì)含量，有利于組織器官發(fā)育?？梢娨蚁ΣＡ缱饔檬禽^為復雜。2．李云等發(fā)