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cd19car-細(xì)胞治療成人急性淋巴細(xì)胞白血病的研究進(jìn)展

急性淋巴結(jié)出血(i)是成人常見的急性淋巴結(jié)出血類型之一,主要分為b-異議和t-擁擠。其中B-ALL最為常見,其發(fā)病率約占ALL的85%CRS是由CARs與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的同源抗原結(jié)合后T細(xì)胞活化引發(fā)的1數(shù)據(jù)和方法數(shù)據(jù)收集患者知情同意書回顧性分析2015年8月至2018年2月到我科接受CD19CAR-T細(xì)胞治療的復(fù)發(fā)/難治B-ALL患者23例,診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)《成人急性B淋巴細(xì)胞白血病診療指南》2015年版。所有接受CD19CAR-T細(xì)胞治療的患者對研究內(nèi)容完全知情,并簽署知情同意書,該研究獲得醫(yī)院學(xué)術(shù)技術(shù)委員會和大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。同時在美國國家臨床實(shí)驗(yàn)中心注冊備案(NCT02735291),接受CAR-T治療患者的入組標(biāo)準(zhǔn)及治療方法,安全性和療效等已在2018第61屆美國血液學(xué)年會上發(fā)表(/ash/2018/webprogram/Paper110539.html),具體見本課題組已發(fā)表的研究摘要外周血輸注后外周血75ml的檢測輸注CD19CAR-T細(xì)胞前1d、輸注CD19CAR-T細(xì)胞結(jié)束后2h、輸注后3周內(nèi)早晨空腹、發(fā)熱時(T>38.5℃)、退熱后第2天空腹時采集外周血3~5ml,所有標(biāo)本均采集至乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)抗凝管保存,后150r/min離心5min取血清,置于-80℃保存。癥狀、體征CRS的診斷需滿足在輸注CAR-T細(xì)胞后3周內(nèi)出現(xiàn)以下4種癥狀或體征中的至少1種:發(fā)熱≥38℃;收縮壓<90mmHg的低血壓;缺氧與動脈血氧飽和度<90%;和/或器官毒性的證據(jù)方法cd19car在t細(xì)胞的轉(zhuǎn)染①分離PBMC。采集復(fù)發(fā)難治性B-ALL患者80~120ml外周血分離PBMC。②將PBMC在抗CD3/CD28單克隆抗體(eBioscience,USA)和IL-2(SLPharm,Beijing)刺激下短暫培養(yǎng)1~2d,然后采用慢病毒法將CD19CAR轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞后繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)10~12d。③對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染率、活性度、病原體等系列檢測,質(zhì)量合格后轉(zhuǎn)入含有人血清白蛋白的100ml生理鹽水的輸液袋中,每體重組患者單個療程回輸CAR-T細(xì)胞計(jì)量為每公斤1×10ssr-pcr反應(yīng)蛋白和抗體的表達(dá)其中IL-6、IFN-γ檢測23例,IL-10、TNF-α由于標(biāo)本量少、標(biāo)本丟失、檢測不當(dāng)?shù)仍驅(qū)嶋H檢測患者共13例,免疫比濁法檢測CRP患者23例。CBA法和免疫比濁法具體步驟如下:將人細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品,按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256梯度稀釋。捕獲抗體充分振蕩混勻,取1μl/樣本加入500μlBuffer振蕩后離心(200g,5min)棄上清,加入BeadBiluent50μl/樣品,吹打混勻反應(yīng)15min。標(biāo)記好樣品的管,取50μl/管上述步驟后再取50μl/管血清,吹打混勻避光1h,檢測抗體充分振蕩混勻,檢測抗體1μl/樣本,再取DetectionDiluent49μl/樣本避光吹打混勻,取50μl混合好的檢測抗體加入樣品中(50μl/樣本),吹打混勻避光2h,加入1000μlWashBuffer洗液(1000μl/樣本),吹打混勻(200g,5min)離心棄上清,加入300μlWashBuffer上機(jī)檢測,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將標(biāo)本數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合,計(jì)算出細(xì)胞因子濃度。免疫比濁法C反應(yīng)蛋白與特異抗體結(jié)合。形成不可溶的抗原抗體復(fù)合物。SYNCHRON系統(tǒng)按照比例自動把適量體積的樣品和試劑分配到一個反應(yīng)杯中。所用的樣品對試劑比例為1∶26。系統(tǒng)將檢測340nm的光吸收變化。此光吸收變化與樣品中C反應(yīng)蛋白濃度成正比。系統(tǒng)依此并根據(jù)一條以單點(diǎn)調(diào)整、預(yù)先確定的校正曲線計(jì)算并給出C反應(yīng)蛋白的濃度。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,根據(jù)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法,呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù),選擇2結(jié)果一性別、年齡及復(fù)發(fā)次數(shù)本研究共入組了23例復(fù)發(fā)/難治性B-ALL患者。其中男16例,女7例。中位年齡22歲。其中15例復(fù)發(fā)≤1次,8例復(fù)發(fā)≥2次。2例患者染色體Phcd19car-t輸注前后胞因子水平的變化為了分析CD19CAR-T細(xì)胞治療后患者細(xì)胞因子水平變化,我們檢測了所有患者在輸注CD19CAR-T細(xì)胞前及輸注后血清細(xì)胞因子水平。所有患者輸注CD19CAR-T細(xì)胞后均檢測至少3次,標(biāo)本采集時間點(diǎn)為輸注CD19CAR-T細(xì)胞結(jié)束后2h、輸注后3周內(nèi)早晨空腹、發(fā)熱時(T>38.5℃)、退熱后第2天空腹時。然后,我們分析比較了輸注后3周內(nèi)細(xì)胞因子最高水平與輸注前的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與輸注CD19CAR-T細(xì)胞前相比,輸注后血清中IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α水平顯著性升高,(car-t細(xì)胞治療后重度crs患者血清細(xì)胞因子表達(dá)差異所有患者在接受CD19CAR-T細(xì)胞治療后均出現(xiàn)了不同程度的CRS。為了分析CD19CAR-T細(xì)胞治療后輕度及重度CRS患者血清細(xì)胞因子表達(dá)譜,我們分析比較這些患者血清具體細(xì)胞因子表達(dá)水平差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn):輸注CD19CAR-T細(xì)胞后,重度CRS患者血清中各細(xì)胞因子水平IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α和CRP均顯著高于輕度CRS組(不及時處理死亡率CD19CAR-T細(xì)胞治療后患者若出現(xiàn)重度CRS往往病情危重,若不及時處理死亡率極高。本研究中4例IL-6水平顯著升高的重度CRS患者接受了IL-6受體拮抗劑治療后好轉(zhuǎn)。4例患者2周左右恢復(fù)正常,見圖5。兩組il-6、ifn-、il-10、tnf-細(xì)胞因子與crp水平的比較CD19CAR-T細(xì)胞治療后4周內(nèi)是否緩解分為CR/CRi組與NR組,比較CR/CRi組與NR組,兩組間IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子與CRP水平,其中CR組/CRi組與NR組的IL-6、IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α細(xì)胞因子與CRP水平無顯著性差異,見表4。3car-t細(xì)胞治療復(fù)發(fā)難治性b-氧化的應(yīng)用據(jù)文獻(xiàn)報道CD19CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤CRS發(fā)生率高達(dá)100%綜上所述,CD19CAR-

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