腈水解酶基因bxnrd127的突變分析

腈水解酶基因bxnrd127的突變分析

草和作物之間的水、料和光的競爭，影響植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。利用化學(xué)方法來控制雜草已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)不可缺少的一部分,除草劑的年產(chǎn)量已居諸農(nóng)藥之首,據(jù)估計美國每年用在除草劑上的費用大約是50億美元。溴苯腈(3,5-二溴-4-羥基-1-氰基苯)以及它的鈉鹽、鉀鹽是一種在國外被廣泛使用的非選擇性芽后莖葉處理觸殺型除草劑。主要由葉片吸收,通過抑制光合系統(tǒng)11.1酶和主試劑之間的關(guān)系限制性內(nèi)切酶、1.2粒、標(biāo)簽和蘑菇質(zhì)粒1.3引用產(chǎn)品由上海博亞公司合成。共13條,具體序列如下:1.4基因bxn-rd127的完全回復(fù)突變和一系列突變體的構(gòu)建對質(zhì)粒對完成第二處回復(fù)突變的650反應(yīng)程序:先94℃變性31.5包含聲明的結(jié)構(gòu)4個bxn基因突變體酵母表達載體的構(gòu)建:完全回復(fù)突變基因植物表達載體構(gòu)建:采用1.6bxn突變基因母細胞培養(yǎng)將Bg1.7通過母系轉(zhuǎn)移瘤的產(chǎn)物活性測試各類轉(zhuǎn)基因酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)481.8農(nóng)業(yè)消毒和草轉(zhuǎn)化應(yīng)用液氮凍融法將1.9轉(zhuǎn)草試驗包括22.1基因bxn-調(diào)解127的結(jié)果和分析通過上海博亞公司測序,獲得了質(zhì)粒2.2bxn-代丁酸,vgp,雙價酵母基質(zhì)粒bxn-代丁酸,雙價酵母基質(zhì)粒bxn-代丁酸,土壤氨基酸殘基,總壓高為了確定4處突變中,那一處是導(dǎo)致基因功能喪失的關(guān)鍵變異,本組首先對bxn-RD127基因進行完全回復(fù)突變,并與vgb基因一起構(gòu)建出雙價酵母表達載體以質(zhì)粒bxn-RD127的第4處變異引起一個包含18個氨基酸殘基的移碼突變,其中包含348位的2.3系列+2.4系列bxn基因的表達產(chǎn)物為含349個氨基酸殘基的蛋白,分子量約為37.812.5關(guān)于旋轉(zhuǎn)母性的產(chǎn)物活性的測定溴苯腈溶液為乳濁液,腈水解酶可以將其苯環(huán)上的-結(jié)果表明:正對照的發(fā)酵液上清可使溴苯腈溶液變清亮,2.6植物起源和形態(tài)的測定+2.7轉(zhuǎn)草率采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草2.8雜草抗原劑的抗劑溴苯腈除草劑的田間噴施濃度為450～10002.9草腈水解酶活性檢測將溴苯腈原液加入煙草葉片蛋白粗提液中至終濃度為0.5%,37℃溫育303基因產(chǎn)物的耐藥為了確定將完全回復(fù)突變的bxn基因轉(zhuǎn)化煙草后,獲得的31株轉(zhuǎn)基因煙草植株均具有抗溴苯腈除草劑的特性,均能在溴苯腈正常施用濃度下生長,同時,轉(zhuǎn)基因煙草葉片蛋白粗提液可使溴苯腈溶液變清亮,證明經(jīng)過完全回復(fù)突變的bxn基因可在轉(zhuǎn)基因煙草植株中表達出活性腈水解酶,解除除草劑溴苯腈的毒性;另外,加大溴苯腈施用濃度后有5株轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)受害癥狀,其余26株表現(xiàn)正常,說明不同的轉(zhuǎn)基因植株間存在通過對bxn-RP6a:5′-CCAAGCTTAGGAATGTCCCCAATAAC-3′。其中FP1和RP1為基因650bp片段首尾引物,FP2和RP2是針對第一處突變點設(shè)計的回復(fù)突變引物(下劃線部分為引入的正確序列,下同);FP3和RP3是針對第二處突變點設(shè)計的回復(fù)突變引物;FP4和RP4是針對第三處突變點設(shè)計的回復(fù)突變引物;FP