牛病毒病的多重檢測(cè)完稿

牛病毒病的多重檢測(cè)完稿第1頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月摘要在臨床上，牛的皰疹病毒(BHV-1)

,副流感病毒(PI3V)

,腹瀉病毒(BVDV)

，牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)的診斷和監(jiān)測(cè)常用ELISA方法。目前利用Luminex技術(shù)在血清學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)上同時(shí)檢測(cè)幾種病毒的所有抗體的方法已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)在Luminex體系中，病毒的抗原和熒光微球偶聯(lián)，檢測(cè)血清樣品。ELISA檢測(cè)作為對(duì)照。與單獨(dú)的ELISA檢測(cè)相比，BHV-14和PI3VLuminex的多重檢測(cè)表現(xiàn)出相似的敏感性和特異性。BVDV和BRSV的檢測(cè)不是很成功，可能因?yàn)檫@些抗原的信號(hào)強(qiáng)度較弱，不能有效區(qū)分陽(yáng)性和陰性樣品。在Luminex體系中，BVDV的重組抗原在信號(hào)強(qiáng)度方面比未加工的BVDV抗原有所增加。第2頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究背景牛傳染性鼻氣管炎由牛皰疹病毒(BHV-1)，副流感病毒(PI3V)，牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV）引起的牛的呼吸道傳染病。BVDV和BHV-1也引起繁殖障礙，導(dǎo)致先天性流產(chǎn)和死胎。ELISA是常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，也適用于高通量篩選。在標(biāo)準(zhǔn)品阻斷ELISA檢測(cè)方法中所用的捕獲抗原，是未經(jīng)處理的病毒或來(lái)自組織培養(yǎng)病毒收獲的細(xì)胞裂解液中純化的病毒抗原，或者是純化的具免疫原性的重組病毒蛋白但是ELISA方法的局限是在一個(gè)樣品中只能使用一種生物素標(biāo)記。因此，同樣的血清樣品必須用幾種單獨(dú)的ELISA進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)在同樣的測(cè)定體系中能夠檢測(cè)幾種靶標(biāo)的多重檢測(cè)技術(shù)對(duì)常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)將有利于減少人力和物力，是一種新型的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法第3頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Luminex多重檢測(cè)原理液相芯片（LiquidArray)檢測(cè)系統(tǒng)是由聚苯乙烯材料所制作的大小均一的圓形微球（直徑為5.6um)，在其制作過(guò)程中包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑兩種熒光染料，而產(chǎn)生100種不同比例顏色微球，每個(gè)微球都有獨(dú)特的色彩編號(hào)，具有其獨(dú)特的地址。100種微球可依不同研究目的而偶聯(lián)100種探針（如抗原、抗體、核酸、酶、各種受體等），這樣可以同時(shí)對(duì)一個(gè)待測(cè)樣本中的100種不同的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)過(guò)程中，微球單個(gè)逐一通過(guò)檢測(cè)通道，微球通過(guò)檢測(cè)通道時(shí)受到兩束激光的同時(shí)照射，第一束635nm紅色激光微球內(nèi)部的突光物質(zhì)，根據(jù)焚光編碼確定微球的類(lèi)別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質(zhì)受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長(zhǎng)的熒光，不同類(lèi)別微球內(nèi)這兩種熒光物質(zhì)比例不同，則熒光強(qiáng)度比率也不同，從而將不同的特異性反應(yīng)區(qū)分開(kāi)來(lái)（定性、分類(lèi)）；第二束紫色激光激發(fā)報(bào)告分子上的熒光素，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定微球上結(jié)合的報(bào)告分子（如SA-PE)的數(shù)量，從而確定目標(biāo)分子數(shù)量（定量）系統(tǒng)只記錄與紅色熒光同時(shí)出現(xiàn)的綠色熒光信號(hào)，不記錄未結(jié)合的報(bào)告分子熒光信號(hào)。最后通過(guò)分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，分析兩道激光所激發(fā)的微球種類(lèi)與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣木中有無(wú)待檢測(cè)病原體存在，或檢測(cè)同時(shí)存在幾種或數(shù)十種病原體。第4頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月文章布局樣品（陽(yáng)性抗血清的制備；田間樣品的采集）抗原制備ELISA檢測(cè)抗原和Luminex微球的偶聯(lián)（2步法）Luminex多重檢測(cè)多重檢測(cè)的可行性分析試驗(yàn)抗原的最佳稀釋度確定陽(yáng)性抗血清的特異性檢測(cè)田間樣品平行試驗(yàn)批內(nèi)和批間的變異性分析BVDV的E2重組蛋白作為抗原的分析試驗(yàn)結(jié)果討論第5頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.11陽(yáng)性抗血清的制備陽(yáng)性對(duì)照抗血清來(lái)自試驗(yàn)感染的動(dòng)物，BHV1抗血清來(lái)自斷奶牛犢，鼻內(nèi)或靜脈接種BHV1的1和2亞型。BVDV抗血清來(lái)自于隔離培養(yǎng)的無(wú)特定病原體動(dòng)物，鼻內(nèi)和靜脈注射BVDV的11亞型。BRSV和PI3V的陽(yáng)性對(duì)照抗血清由疫苗接種獲得。第6頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.12田間樣品的采集實(shí)驗(yàn)組血清來(lái)自于一定區(qū)域內(nèi)不同品種，不同飼養(yǎng)場(chǎng)，圈養(yǎng)或散養(yǎng)的牛群（公畜或母畜）采集對(duì)象為診斷有呼吸系統(tǒng)疾病動(dòng)物：如腹瀉，抑郁，消瘦等。以及一些有繁殖障礙或死亡的家畜第7頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.2

抗原制備BHV1,PI3V,BVDV

和

BRSV的病毒抗原來(lái)自于未處理的細(xì)胞增值的病毒。BHV1(OxfordED6株),PI3(TI株)來(lái)自于牛腎細(xì)胞增值的的病毒，BRSV來(lái)自牛腎單層細(xì)胞增值的病毒，BVDV來(lái)自小牛睪丸細(xì)胞增值的病毒，待細(xì)胞病變達(dá)到80％-90％時(shí)，收集病毒，1500g離心，收取上清液。作為陽(yáng)性抗原，陰性對(duì)照為沒(méi)有增值病毒的細(xì)胞離心后的上清液。第8頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.3ELISA檢測(cè)

（1）BHV1,PI3V,BVDV，BRSV

抗原及其對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照抗原用包被緩沖液分別做1:1500,1:900,1:600and1:500

稀釋?zhuān)靠准?0ul。（2）4℃孵育過(guò)夜，用含0.05%Tween20的PBS沖洗酶標(biāo)板3次，（3）每孔加入50ul1:100稀釋的BHV1,PI3V

和BRSV，1:50稀釋的BVDV的血清，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性血清對(duì)照組每孔都分別做兩個(gè)重復(fù)。BHV1,PI3V和BRSV組室溫避光孵育2h，BVDV37℃孵育1h（4）洗滌液沖洗酶標(biāo)板5次。（5）每孔加入50ul辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛的二抗。（6）BHV1,PI3V

和BRSV室溫避光孵育1h。BVDV37℃孵育1h。（7）每孔加入50ulTMB37℃避光顯色5-10min（8）每孔加入50ul2M

硫酸終止反應(yīng)。（9）檢測(cè)OD值第9頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.4

抗原和Luminex微球的偶聯(lián)2步法：包括微球活化，微球和抗原的偶聯(lián)（1）BHV-1,PI3V,BVDV和BRSV和陰性對(duì)照樣品用500ul的0.1M的PBS稀釋?zhuān)?）微球儲(chǔ)存液超聲漩渦震蕩20s，取80ul（含106個(gè)微球）微球儲(chǔ)存液于1.5ml的離心管（3）13,000×g離心3min，超聲20s（4）小心棄去上清（5）用0.1M的活化緩沖液磷酸鹽清洗微球兩次，然后用80ul的活化緩沖液懸浮微球（6）先后加入10ul新鮮配制的Sulfo-NHS

溶液(50mg/mL)、10ulEDC

溶液(50mg/mL),混勻,室溫避光振搖20min。（9）然后離心，棄上清。用含0.05%吐溫的0.1MPBS

（交聯(lián)緩沖液）清洗兩次，（10）加入陽(yáng)性和陰性抗原稀釋液，并用交聯(lián)緩沖液補(bǔ)足體積至500ul。室溫避光溫和振蕩2h。離心微球，棄上清。沉淀加入1ml交聯(lián)緩沖液清洗兩次。然后加入250ul封閉/貯存液重懸微球，4℃避光保存。第10頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.5Luminex多重檢測(cè)每孔加入100ul儲(chǔ)存緩沖液，500g離心30s偶聯(lián)有BHV1,PI3V,BVDV和BRSV陽(yáng)性和陰性抗原的8種微球14000g離心3min，超聲漩渦震蕩分散微球調(diào)整微球濃度至8×105beads/ml，，在濾板的每個(gè)檢測(cè)孔加入10μＬ稀釋好的微球（每孔含偶聯(lián)微球總個(gè)數(shù)約為8000個(gè)）。待檢血清樣品用稀釋緩沖液（含0.05%吐溫20,0.05%疊氮鈉,1%魚(yú)明膠的PBS）按１∶300比例稀釋?zhuān)總€(gè)樣品孔加入100μＬ，每個(gè)樣品做２孔重復(fù)；在對(duì)照孔中加入100ul陰性血清稀釋液個(gè)）放置于平板混勻器，室溫避光孵1h。每孔用100ul的緩沖液洗滌，500×g離心30s第11頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Luminex多重檢測(cè)每孔加入1∶50稀釋的生物素標(biāo)記的鼠抗牛IgG抗體100ul。室溫避光孵育1h。

洗滌，每孔加入4ug/ul的鏈霉素－藻紅蛋白（SA-PE）100ul。放置于平板混勻器，室溫避光孵育30min。每孔加入100ul的洗滌緩沖液清洗兩次，然后加入100ul的分析緩沖液重懸微球，Luminex檢測(cè)，設(shè)置儀器每次只檢測(cè)相應(yīng)編碼的熒光微球?qū)⒎磻?yīng)板放入Luminex檢測(cè)系統(tǒng)中讀取每孔MFI值。BHV1,PI3,BVDV和BRSV與之偶聯(lián)的微球編號(hào)分別為035,033,037和042，相應(yīng)的陰性抗原偶聯(lián)的微球分別為036,034,038和043。第12頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.6

多重檢測(cè)的可行性試驗(yàn)在Luminex實(shí)驗(yàn)中，用未處理的細(xì)胞毒作為抗原在實(shí)驗(yàn)的可行性方面和ELISA做了一個(gè)比較。BHV1,PI3V,BVDV，BRSV抗原及其分別對(duì)應(yīng)的陰性抗原用偶聯(lián)緩沖液10倍稀釋?zhuān)謩e和8種不同編號(hào)的微球偶聯(lián)。4種病毒的陽(yáng)性抗血清進(jìn)行系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋孔3個(gè)重復(fù)。然后用Luminex多重檢測(cè)檢測(cè)，平行試驗(yàn)用ELISA分別檢測(cè)。第13頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.7

抗原稀釋度的最優(yōu)化在可行性實(shí)驗(yàn)中，與微球偶聯(lián)的病毒抗原10倍稀釋。為了確定病毒抗原稀釋后是否能改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果，和微球偶聯(lián)前將抗原分別作10倍，100倍，500倍，1000倍稀釋。結(jié)果用300倍稀釋的BHV1,PI3，BRSV和BVDV的陽(yáng)性抗血清進(jìn)行檢測(cè)。（抗原稀釋后有利于田間樣品檢驗(yàn)。）第14頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.8陽(yáng)性抗血清的特異性檢測(cè)BHV1,PI3V,BVDV和

BRSV陽(yáng)性對(duì)抗血清的特異性檢測(cè)，已在2.3和2.5中利用ELISA和Luminex技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。第15頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.9田間樣品平行試驗(yàn)用Luminex和ELISA檢測(cè)了306個(gè)田間樣品，這些樣品中至少包含100個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，和100個(gè)陰性對(duì)照樣品，每個(gè)檢樣孔做兩個(gè)重復(fù)。Luminex多重檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度（MFI）為陽(yáng)性樣品產(chǎn)生的信號(hào)值減去陰性對(duì)照樣品產(chǎn)生的熒光信號(hào)值。ROC曲線可最大限度的展示Luminex檢測(cè)的敏感性和特異性。第16頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.10

批內(nèi)和批間變異性分析

將含針對(duì)四種抗原的陽(yáng)性抗血清300倍稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行7個(gè)單獨(dú)的多重檢測(cè)，每組設(shè)2-4個(gè)重復(fù)，一共21個(gè)重復(fù)。

批內(nèi)試驗(yàn)設(shè)置同批間試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前田間樣品已用ELISA檢測(cè)，確保含有針對(duì)以上四種病毒的抗體。

第17頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.11

BVDV的重組E蛋白作為抗原的檢測(cè)BVDV的E2基因亞克隆到桿狀病毒pBacPAK9載體，將桿狀病毒和BVDVE2基因共轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，表達(dá)重組蛋白。產(chǎn)生的重組蛋白用westernblot方法，BVDV的特異性抗體檢測(cè)。帶His標(biāo)簽的重組E2蛋白用鎳離子柱純化。將重組的E2蛋白和陰性對(duì)照抗原，細(xì)胞培養(yǎng)獲得病毒抗原分別做1:50,1:109，1:350稀釋?zhuān)悸?lián)微球，和相同稀釋度的BVDV的陽(yáng)性抗血清反應(yīng)，比較重組蛋白和BVDV未處理的細(xì)胞毒作為抗原產(chǎn)生的熒光信號(hào)值。第18頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Luminex技術(shù)對(duì)含有4種病毒的抗體的陽(yáng)性抗血清的多重檢測(cè)Fig.1.ComparisonofsignalsproducedintheLuminexmultiplexassaybythefourantigenswhentestingpooledcontrolantiserumdilutions(containingantibodiestoallfourantigens).MFI=medianfluorescentintensity.第19頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Luminex和ELISA檢測(cè)結(jié)果比較Fig.2.ComparisonofsignalsfromtheLuminexmultiplexassaywiththeindividualELISAtests,generatedfromtestingdilutionsofapooledcontrolantiserumsample,containingantibodiestoallfourantigens.ThedottedlinerepresentstheELISAcutoff.第20頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗原最佳稀釋度的確定

（1/500forBHV1,1/100forPI3andBRSV,and1/10forBVDV

）Fig.3.ChangesinsignalsresultingfromconjugationofdifferentdilutionsofantigentoLuminexbeadsandsubsequentreactionwithacontrolpooledantiserumsample.Thenegativeantigenrepresentsthesignalproducedbynon-specificbinding.第21頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月陽(yáng)性抗血清的特異性檢測(cè)用Luminex多重檢測(cè)PI3V的抗血清時(shí)，BVDV出現(xiàn)了弱的信號(hào)，同樣檢BVDV的抗血清時(shí)，PI3V也出現(xiàn)了弱的信號(hào)。用單獨(dú)的ELISA檢測(cè)也證實(shí)了這一現(xiàn)象。不清楚是因?yàn)槎嘀伢w系本身導(dǎo)致的非特異性交叉反應(yīng)還是多重檢測(cè)體系比較精確地檢測(cè)到了非特異性抗體的存在。但是在檢測(cè)臨床樣品時(shí)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)很多交叉反應(yīng)的現(xiàn)象，說(shuō)明陽(yáng)性抗血清中確實(shí)存在其它病毒的抗體，多重檢測(cè)體系也精確檢測(cè)到了此抗體的存在。第22頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以ELISA檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，Luminex檢測(cè)結(jié)果的ROC曲線分析Fig.4.ROCcurveanalysisforthedifferenttestswithintheLuminexmultiplexassayusingELISAasthegoldstandard.Theareasunderthecurve(AUC)areshownwiththegraphs.第23頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Table22×2boxesforeachtestwithintheLuminexmultiplexassay.Luminex相對(duì)ELISA檢測(cè)的特異性和敏感性分析第24頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Table3DiagnosticsensitivityandspecificityofthefourassaysintheLuminexmultiplexassayrelativetotheindividualELISAtests,determinedafterROCanalysistosetcut-offvalues.Luminex相對(duì)ELISA檢測(cè)的特異性和敏感性分析第25頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Fig.5.ScatterdiagramillustratingthedistributionofMFIsignalsforthedifferenttestswithinintheLuminexmultiplexassay.DatapointsontheleftofthegraphsareELISAnegativesamples;datapointsontherightofthegraphsareELISApositivesamples.Luminex檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)圖分布第26頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Table4WithinandbetweenassayvariationofthedifferentassaysintheLuminexMultiplexassay.BHV1

和PI3V的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)（CV）低于10%，說(shuō)明二者的重復(fù)性較好批內(nèi)和批間的變異性分析第27頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Fig.6.ComparisonofsignalproducedwithBVDVrecombinantE2proteinandBVDVvirallysateantigenaftertestingaBVDVantiserumdilutionseriesontheLuminexplatform.（1.）重組抗原在陽(yáng)性血清做1：12150稀釋時(shí)，產(chǎn)生的MFI和virallysateantigen在陽(yáng)性血清做1:50稀釋時(shí)產(chǎn)生的MFI值等同，在5000左右。（2.）在陽(yáng)性抗血清做1:450稀釋時(shí)，陰性對(duì)照抗原產(chǎn)生的MFI有所減少，此時(shí)，重組抗原產(chǎn)生的MFI在3,0000左右具免疫原性的rE2不具免疫原性的rE2virallysateantigen陰性對(duì)照第28頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月討論1.我們利用Luminex體系建立和評(píng)估了檢測(cè)牛四種病毒的抗體的血清學(xué)多重檢測(cè)方法，2.利用細(xì)胞培養(yǎng)的病毒裂解物（ELISA檢測(cè)中常用的抗原）作為抗原可以和微球有效偶聯(lián)，ROC曲線可以將Luminex多重檢測(cè)（相對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果）的結(jié)果敏感性和特異性上放大到最大化3.在Luminex檢測(cè)中，BHV-1和PI3V抗原比PI3V和BRSV的抗原更有效。BVDVandBRSV診斷結(jié)果的不理想主要是因?yàn)镸FI值較低，信噪比較弱。因此，和ELISA相比，陽(yáng)性和陰性樣品BVDV和BRSV批內(nèi)和批間的變異系數(shù)相對(duì)BHV1和P13的變異較高，主要?dú)w因于BVDVandBRSV產(chǎn)生的MFI值相對(duì)較低。較高的MFI值將可減少BVDVandBRSV.的變異系數(shù)，在檢測(cè)PI3V陽(yáng)性對(duì)照抗血清時(shí)，BVDV出現(xiàn)了弱的熒光信號(hào)。在檢測(cè)BVDV陽(yáng)性對(duì)照抗血清時(shí)，PI3V也出現(xiàn)了弱的熒光信號(hào)。不確定是多重檢測(cè)體