海藻酸鈉固定化α淀粉酶的研究

海藻酸鈉固定化α淀粉酶的研究卷,期】2023052023【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)5845-5849【關(guān)鍵詞】海藻酸鈉;固定化;α-淀粉酶;聚乙二醇【作者】鄭璐;雷明科;張瑞;吳元欣【單位】華中農(nóng)業(yè)高校農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室,武漢430070;武漢工程高?；づc制藥學(xué)院,武漢430074;武漢工程高校化工與制藥學(xué)院,武漢430074;華中農(nóng)業(yè)高校農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室,武漢430070;武漢工程高?；づc制藥學(xué)院,武漢430074【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】;925+.1α-淀粉酶α-1,4--葡萄糖-葡萄糖苷水解酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中,它能以隨機(jī)作用的方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1,4葡萄糖苷鍵,產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等,被廣泛應(yīng)用于食品加工、糧食工業(yè)、乙醇工業(yè)、發(fā)酵和紡織業(yè)等多種行業(yè),是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一[1,2]。

固定化酶與游離酶相比,具有熱穩(wěn)定性高、保存穩(wěn)定性好、對(duì)變性劑耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可重復(fù)或連續(xù)使用,且易于與產(chǎn)品分別,是食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的討論熱點(diǎn)之一[3,4]。

依據(jù)酶的性質(zhì)和用途,酶的固定化方法主要可以分為以下4種:吸附法、交聯(lián)法、包埋法和共價(jià)結(jié)合法[5]。

酶的固定化可以使用多種載體,其中海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態(tài)多聚糖,它是由β-1,4--甘露糖醛酸和α-1,4--古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物,其分子含有自由的羧基和羥基,可溶于不同溫度的水中,生物相容性好,穩(wěn)定、無(wú)毒、成膜性或成球性好,是常用的囊材與載體材料,也常被用作固定化酶的載體[6]。

聚乙二醇是一種無(wú)毒的高分子聚合物,與水有極好的互溶性,它的相對(duì)分子質(zhì)量可從幾千到幾萬(wàn),掌握其相對(duì)分子質(zhì)量的大小以及用量,可調(diào)整海藻酸鈣中孔的尺寸、體積和密度[7]。

以聚乙二醇為海藻酸鈉制孔劑,兩者在水溶液中形成均一體系,將兩者混入***化鈣溶液中時(shí),海藻酸鈉轉(zhuǎn)化為交聯(lián)的網(wǎng)狀大分子,海藻酸鈣形成固態(tài),聚乙二醇可以從固態(tài)的海藻酸鈣中溶出,即形成多孔結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣。

當(dāng)聚乙二醇相對(duì)分子質(zhì)量為4000時(shí),海藻酸鈣支架中可形成蓬松勻稱的多孔結(jié)構(gòu),適用于組織工程多孔材料的應(yīng)用[8]。

本試驗(yàn)采納海藻酸鈉包埋交聯(lián)法制備固定化α-淀粉酶,得到最佳的固定效果,并對(duì)游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較。

采納聚乙二醇作為制孔劑,為進(jìn)一步提高固定化α-淀粉酶的酶活性,提高α-淀粉酶的酶學(xué)性能供應(yīng)參考。

1材料與方法儀器與材料試驗(yàn)于2023年5月在武漢工程高校完成。

204型電子分析天平;722型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;81-1型加熱磁力攪拌器上海司樂(lè)儀器廠;-300型多用途水浴恒溫振蕩器江蘇太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠;-22型電熱恒溫水浴鍋上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

試驗(yàn)中使用的α-淀粉酶購(gòu)自北京雙旋微生物培育基制品廠;聚乙二醇4000購(gòu)自公司。

其余試劑均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

試劑純度均為分析純。

方法淀粉溶液多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用法標(biāo)定淀粉溶液中的多糖含量[9]。

分別取40、60、80、100、120μ2%淀粉溶液,下同,計(jì)算多糖含量,稀碘液,用蒸餾水定容至10,混合勻稱后在600波長(zhǎng)下比色。

以吸光度值為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)多糖含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并列出線性回歸方程。

α-淀粉酶的固定化取44%海藻酸鈉溶液,下同,12%羧***纖維素鈉以下簡(jiǎn)稱溶液,下同,22%α-淀粉酶溶液,用蒸餾水定容至10,置于磁力攪拌器上混合勻稱,用5注射器吸取上述混合液,以10%戊二醛的2%***化鈣溶液,下同中,固定后濾出小球,用蒸餾水洗滌2~3次,儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用[10]。

α-淀粉酶活力的測(cè)定以200μ2%淀粉溶液為底物,加入100μ的1醋酸-醋酸鈉緩沖液,400μ蒸餾水,300μ適當(dāng)稀釋的α-淀粉酶溶液,于60℃水浴鍋中精確?????反應(yīng)15,馬上加入鹽酸終止反應(yīng)。

反應(yīng)液,加稀碘液,用蒸餾水定容至,混合勻稱后在600波長(zhǎng)下比色。

固定化酶的活力測(cè)定方法是將上述方法中適當(dāng)稀釋的α-淀粉酶溶液替換為肯定量的固定化α-淀粉酶。

在60℃、,以每反應(yīng)15消耗1多糖的酶量為一個(gè)酶活力單位。

酶的相對(duì)酶活是指在同一組試驗(yàn)中,以活性最高的一組為100,其余的酶活力與之相比,計(jì)算百分?jǐn)?shù)。

單因素試驗(yàn)以固定化酶的相對(duì)酶活為考察指標(biāo),探討海藻酸鈉濃度、酶濃度、***化鈣濃度、濃度對(duì)固定化酶活性的影響。

①不同濃度海藻酸鈉對(duì)固定化酶活性的影響。

%,濃度為%,***化鈣濃度為2%,固定,考察不同濃度的海藻酸鈉%、%、%、%對(duì)固定化酶活性的影響。

②不同濃度酶對(duì)固定化酶活性及固定效率的影響。

當(dāng)海藻酸鈉濃度為2%,濃度為%,***化鈣濃度為2%,固定,考察不同濃度的酶%、%、%、%對(duì)固定化酶活性的影響。

③不同濃度***化鈣對(duì)固定化酶活性的影響。

%,海藻酸鈉濃度為2%,濃度為%,固定,考察不同濃度***化鈣1%、2%、4%、8%對(duì)固定化酶活性的影響。

④不同濃度對(duì)固定化酶活性的影響。

%,海藻酸鈉濃度為2%,***化鈣濃度為2%,,考察不同濃度0、%、%、%、%對(duì)固定化酶活性的影響。

正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以酶濃度、***化鈣濃度、濃度、海藻酸鈉濃度4個(gè)因素進(jìn)行934正交試驗(yàn),以獲得最佳固定條件,試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1正交試驗(yàn)因素和水平單位:%因素水平***化鈣濃度123酶濃度123濃度數(shù)據(jù)分析采納-5軟件分析固定化酶的直徑。

2結(jié)果與分析固定化α-淀粉酶的單因素試驗(yàn)不同濃度海藻酸鈉對(duì)固定化酶活性的影響分別取濃度為%、%、%、%的海藻酸鈉溶液進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知,%時(shí),固定化酶活性最大,當(dāng)海藻酸鈉濃度連續(xù)增大時(shí),固定化酶活性有所下降,其黏度增大,難以擠壓成球狀,并且所形成的凝膠小球體積過(guò)大,影響酶與底物充分結(jié)合。

由圖2可知,4種不同濃度海藻酸鈉固定化酶的平均直徑分別為、、、,即當(dāng)海藻酸鈉濃度漸漸增大時(shí),固定化酶小球的直徑隨之增大。

產(chǎn)生這一現(xiàn)象的緣由在于當(dāng)海藻酸鈉濃度增大時(shí),單位體積中能與鈣離子結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量也相應(yīng)增加,進(jìn)而得到直徑較大的固定化酶小球。

圖1不同濃度海藻酸鈉對(duì)固定化酶活性的影響圖2不同濃度海藻酸鈉對(duì)固定化酶形態(tài)的影響不同濃度酶對(duì)固定化酶活性及固定效率的影響分別取濃度為%、%、%、%的酶液進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知,當(dāng)α-%%時(shí),固定化酶的活性先增高而后趨于穩(wěn)定,但固定效率卻逐步降低。

這主要是由于固定化酶凝膠小球內(nèi)固定的酶量先漸漸增加而后趨于飽和,過(guò)多結(jié)合的酶造成酶分子聚集成團(tuán),酶分子活性中心可能被部分遮蓋,與底物不能充分接觸,從而影響固定化酶活性與固定效率。

圖3不同濃度酶對(duì)固定化酶活性及固定效率的影響不同濃度***化鈣對(duì)固定化酶活性的影響分別取濃度為1%、2%、4%、8%的***化鈣溶液進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知,固定化酶活性在***化鈣濃度變化范圍內(nèi)先增加而后漸漸降低。

當(dāng)***化鈣濃度為2%時(shí),固定化酶相對(duì)活性最高,固定效果最佳。

圖4不同濃度***化鈣對(duì)固定化酶活性的影響4種不同濃度***化鈣制備的固定化酶平均直徑分別為、、、圖5,即當(dāng)***化鈣濃度漸漸增加時(shí),固定化酶的直徑隨之減小。

推想可能是海藻酸鈉中的α-1,4-古羅糖醛酸結(jié)構(gòu)與鈣離子交聯(lián)形成蛋盒-結(jié)構(gòu),***化鈣主要影響的是交聯(lián)程度,其濃度越高,固定化酶結(jié)構(gòu)的致密程度越高,因此濃度大的***化鈣會(huì)降低固定化酶的活性與直徑。

圖5不同濃度***不同濃度對(duì)固定化酶活性的影響分別取濃度為0、%、%、%、%的溶液進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知,%時(shí),固定效果最佳。

固定化酶活性隨濃度的增加漸漸上升,%時(shí),混合液的黏度增加,固定化酶活性降低。

固定化α-淀粉酶的正交試驗(yàn)圖6不同濃度對(duì)固定化酶活性的影響正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知,最佳固定化酶的制備工藝為1221,其中各因素影響大小依次為、、、。

利用最佳組合淀粉酶%,***化鈣2%,羧***纖維素鈉%,海藻酸鈉%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),%。

可見(jiàn),優(yōu)化后的工藝固定效率較高,穩(wěn)定可行。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)號(hào)1234567891111222333123123123123231312123312231固定效率%23固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較對(duì)固定化酶與游離酶活性的影響在最佳工藝條件下,取、、、、、、,測(cè)定游離酶與固定化酶的活性,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知,,與游離酶相對(duì)活性相比,固定化酶的相對(duì)酶活變化幅度不大,即固定化酶在變化范圍內(nèi)能夠保持相對(duì)較高的酶活,相比游離酶具有更寬的適應(yīng)性。

圖7對(duì)固定化酶與游離酶活性的影響溫度對(duì)固定化酶與游離酶活性的影響在最佳工藝條件下,于45~80℃測(cè)定游離酶與固定化酶活性,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知,游離酶被固定化以后,其最適反應(yīng)溫度由原來(lái)的60℃上升至65℃,當(dāng)反應(yīng)溫度連續(xù)提高時(shí),固定化酶活性明顯高于游離酶,這可能是由于固定化載體提高了酶空間結(jié)構(gòu)對(duì)熱的穩(wěn)定性。

圖8溫度對(duì)固定化酶與游離酶活性的影響固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的比較將游離酶與固定化酶分別在60、75、90℃后再測(cè)定酶活,以放置在4℃冰箱內(nèi)的游離酶與固定化酶作為對(duì)比,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知,在高溫條件下,固定化酶活性損失明顯小于游離酶,即使在90℃,其仍能保持33%左右的相對(duì)酶活,而游離酶的相對(duì)酶活只剩不到10%。

圖9固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的比較不同濃度聚乙二醇對(duì)固定化酶活性的影響分別加入濃度為%、%、%、%、%、%、%的聚乙二醇4000制備多孔固定化酶,以不加聚乙二醇的樣品作為對(duì)比,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。

由圖10可知,添加聚乙二醇4000后,固定化酶活性均高于對(duì)比,%時(shí),固定化酶活性最高,,明顯有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

游離酶與固定化酶米氏常數(shù)的比較利用-作圖法以1對(duì)1[]作圖,根據(jù)直線在橫軸上的截距-1求米氏常數(shù),結(jié)果見(jiàn)圖11。

結(jié)果表明,,添加聚乙二醇固定化酶的為,而游離酶的為,即不加聚乙二醇的固定化酶對(duì)底物的親和力最小,這與固定化載體的空間障礙與集中限制有關(guān);添加聚乙二醇后,固定化酶形成的多孔結(jié)構(gòu)有利于提高對(duì)底物的親和力,且這2種固定化酶對(duì)底物的親和力均小于游離酶。

圖10不同濃度聚乙二醇對(duì)固定化酶活性的影響圖11游離酶與固定化酶米氏常數(shù)的比較3小結(jié)本試驗(yàn)采納海藻酸鈉包埋交聯(lián)法制備固定化α-淀粉酶,探討了最佳