銀杏葉提取物中總黃酮的含量測定

銀杏葉提取物中總黃酮的含量測定

銀杏是一種古老的遺跡植物，其療效最初記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。對(duì)潤肥、哮喘、止咳等疾病也有治療作用。系為銀杏科銀杏屬植物,又名公孫樹,為我國特有樹種。銀杏葉為銀杏的干燥葉,其提取物中主要含有黃酮類化合物和二萜類化合物,它們具有改善心腦血管循環(huán)、抑制血小板凝聚酶、抗菌、抗病毒、抗癌等作用文獻(xiàn)中有采用紫外可見分光光度法1、材料和機(jī)器1.1、合成藥物銀杏葉(河南省銀杏科學(xué)技術(shù)開發(fā)中心提供);銀杏葉提取物(河南魯山縣銀杏葉提取廠和本實(shí)驗(yàn)室提供);DM130樹脂(山東齊魯抗生素廠);蘆丁、槲皮素(中國藥品生物制品檢定所);山柰酚、異鼠李素(Sigma公司);甲醇、乙醇、丙酮(為工業(yè)原料或分析純);其它試劑均為分析純。1.2、水質(zhì)、設(shè)備以及泵系統(tǒng)UV-4600型紫外可見分光光度計(jì)(瑞典Pharmacia公司);高效液相色譜儀,配備有600E型泵系統(tǒng),966型二極管陣列檢測器,RCMC18(8.0×1.0cm,粒度:5μm)徑向加壓柱(美國Waters公司);樹脂柱(有機(jī)玻璃柱,高55cm,上端直徑11cm,下端直徑8cm);CL-25型蠕動(dòng)泵(北京宣武超濾設(shè)備廠);PTGCPrep超濾柱(美國Milipore公司)。2、方法和結(jié)果2.1、銀杏葉提取物的制備2.2、提取物的制備方法:取200g干銀杏葉粉碎,浸泡在2000ml70%乙醇中,在水浴上加熱回流提取2次,每次各3小時(shí),過濾,2次濾液合并,在水浴上減壓蒸餾,除去溶劑,用石油醚脫脂2次水溶液濃縮至原體積的1/10,后用20%乙醇懸浮,過濾,濾液中加入少量的硼砂,在水浴上減壓蒸餾,回收乙醇,水液在水浴上濃縮成漿液狀,控制在60℃溫度下真空干燥,得提取物29.35g。2.2.1分光光度法2.2.1.容量瓶的制備標(biāo)準(zhǔn)液的配制:精密稱取蘆丁對(duì)照品23mg,置于100ml容量瓶中,用30%乙醇溶解,定容,備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別精密吸取上述蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1、2、3、4ml各置于10ml容量瓶中,加30%乙醇5ml、5%NaNO2.2.1.2.測量條件的選擇以蘆丁為對(duì)照品,取銀杏葉提取物約0.02g置于10ml量瓶中,同上操作,以試液作空白,分別加入NaNO2.2.1.總黃酮含量的測定精密稱取銀杏葉提取物約0.02g,置10ml量瓶中加30%乙醇溶液,按上述方法操作并用30%乙醇定容,測定,用回歸方程計(jì)算總黃酮的含量,結(jié)果見表1。2.2.2高效液相色譜法2.2.2.流動(dòng)相0.4%磷酸溶液色譜柱:RCMC18(8.0×1.0cm,粒度:5μm)徑向加壓柱;流動(dòng)相:甲醇-0.4%磷酸溶液(55:45);流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:10μ1;檢測波長:360nm;柱溫:25℃。2.2.2.配制0.5%鹽酸溶液銀杏葉提取物樣品制備:精密稱取銀杏葉提取物0.1g,加甲醇20ml使其完全溶解,加入1.5mol/L鹽酸20ml,搖勻,回流2小時(shí),冷卻,轉(zhuǎn)入50ml量瓶中并用甲醇定容,過濾備用。銀杏葉樣品的制備:取銀杏葉1.5g,在索氏提取器中用甲醇提取8小時(shí),60℃以下濃縮至15ml,加入1.5mol/L鹽酸20ml,混勻,回流2小時(shí),冷卻,轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中并用甲醇定容,過濾備用。2.2.2.黃酮含量測定(1)三對(duì)照品測定方法銀杏葉提取物酸水解后主要為3中甙元:槲皮素、山柰酚、異鼠李素,按上述色譜條件可將這3種甙元完全分開,用外標(biāo)法進(jìn)行含量分析,以3個(gè)對(duì)照品對(duì)6份銀杏葉提取物和5份銀杏葉樣品進(jìn)行測定,結(jié)果見表1,表2。(2)單對(duì)照品測定法標(biāo)準(zhǔn)曲線:將濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.07mg/的槲皮素對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣,以面積(A)對(duì)相應(yīng)的進(jìn)樣量Q(μg)計(jì)算回歸方程:A=3.800×10按上述方法對(duì)銀杏葉提取物及銀杏葉樣品總黃酮含量測定,峰面積乘以校正因子2.51,再求出含量,結(jié)果見表1,表2。精密度測定:取濃度為0.02mg/ml的槲皮素對(duì)照品溶液,按上述條件重復(fù)進(jìn)樣6次,每次10μl測得其精密度RSD=3.2%(n=6)?；厥章蕼y定:精密稱取銀杏葉提取物0.1g,加入槲皮素對(duì)照品2mg,按上述方法測槲皮素的回收率,得平均回收率為97.9%,RSD=2.12%(n=5)。2.3提取工藝條件的選擇2.3.1條件1色譜柱:RCMC2.3.2樣品溶液的制備銀杏葉提取物樣品制備:精密稱取銀杏葉提取物0.1g,加甲醇20ml使其完全溶解,加入1.5mol/L鹽酸20ml,搖勻,回流2小時(shí),冷卻,轉(zhuǎn)入50ml量瓶中并用甲醇定容,過濾備用。2.3.3總黃酮提取率的測定分別配制不同濃度的乙醇(10%~90%)、甲醇(10%~70%)、丙酮(20%~80%)水溶液(v/v)作為提取劑,加入銀杏葉100g,用量為8倍銀杏葉量,回流提取3小時(shí),過濾,真空濃縮、干燥,稱重,測總黃酮含量,計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果顯示以60%丙酮水溶液為提取時(shí),總黃酮提取率達(dá)71.2%,但提取液中脂溶性成分較多,雜質(zhì)含量高,后處理困難。比較甲醇和乙醇水溶液的提取效果,乙醇優(yōu)于甲醇。當(dāng)乙醇嘗試增大到70%以上時(shí),總黃酮提取率趨于穩(wěn)定,一次提取率達(dá)68%以上,所以選用70%的乙醇較宜。2.3.4總黃酮提取率測定取經(jīng)除雜,切條的銀杏葉1000g于20L的提取釜中,加入10倍量的70%乙醇,水浴加熱回流6小時(shí),每隔1小時(shí)取樣50ml,過濾,真空濃縮、干燥、稱重,測量總黃酮含量,計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果顯示回流3小時(shí)后總黃酮提取率隨時(shí)間延長變化趨小,提取率為68%以上。另取同樣銀杏葉一份,加入10倍量的70%乙醇,回流3小時(shí)后,濾出提取液,再加入10倍量的70%乙醇,進(jìn)行第二次回流提取,每隔1小時(shí)取樣50ml,過濾,真空濃縮、干燥、稱重,測總黃酮含量,計(jì)算總黃酮提取率,共提取4小時(shí)。結(jié)果表明顯示第二次回流2小時(shí)后總黃酮提取率趨于穩(wěn)定,第二次總黃酮提取率達(dá)15%以上。兩次提取率之和達(dá)83%以上。2.3.5總黃酮提取率測定取銀杏葉100g,加入不同量的70%乙醇水溶液分別進(jìn)行回流提取,3小時(shí)后過濾,真空濃縮,干燥,稱重,測定其總黃酮含量,計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果顯示,當(dāng)液固比從4增大到8時(shí),總黃酮提取率可以從31.1%增大到68.5%,并趨于穩(wěn)定。2.3.6提取溫度的確定分別取銀杏葉100g按液固比為8:1的比例加70%乙醇,回流提取兩次,第一次3小時(shí),第二次2小時(shí),合并提取液,減壓回收乙醇在40-105℃之間選擇不同的溫度進(jìn)行真空濃縮、干燥,制備提取物,測定其總黃酮含量,計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果表明總黃酮提取率隨濃縮、干燥溫度降低而趨于穩(wěn)定(在82%左右)。至此,確定銀杏葉提取工藝為:以70%乙醇為提取溶劑,用量為銀杏葉8倍量,回流浸提兩次,第一次3小時(shí),第二次2小時(shí),合并提取液,減壓濃縮,回收乙醇,60℃減壓濃縮至粘稠狀,60℃真空干燥箱干燥24小時(shí)。2.4、工藝條件的選擇2.4.1萃取溶液的制備按上述確定的提取工藝路線制得銀杏葉提取液,于60℃減壓濃縮,回收乙醇。殘?jiān)?0倍量的無鹽水,管式離心機(jī)離心除去雜質(zhì),備用。2.4.2黃酮含量測定提取液經(jīng)DM130樹脂柱吸附,用無鹽水沖洗至流出液澄清,再用70%乙醇洗脫,收集流出液至無色,流出液經(jīng)減壓回收乙醇,濃縮、干燥、粉碎,得銀杏葉提取物,稱重并以3.1的方法來測總黃酮含量,結(jié)果見表3。表3數(shù)據(jù)說明了,樹脂吸附單次解吸工藝所得提取物總黃酮平均收率達(dá)77.96%,但總黃酮含量偏低(平18.18%)。2.4.3黃酮含量的測定提取液經(jīng)DM130樹脂柱吸附,用無鹽水沖洗至流出液澄清,然后用5%(V/V)稀乙醇溶液預(yù)洗(用量是柱體積的3倍),再用70%乙醇洗脫解吸,至流出液無色為止,洗脫液經(jīng)減壓回收乙醇,60℃減壓濃縮、真空干燥24小時(shí),粉碎,得銀杏葉提取物,稱重并以3.1的方法來測定總黃酮含量,結(jié)果見表4。表4數(shù)據(jù)說明了采用分組解吸工藝可以提高銀杏葉提取物總黃酮的含量(平均達(dá)26.45%),但降低了總黃酮收率(平均67.21%),這主要由于用分級(jí)解吸,黃酮將隨稀醇液流失。2.4.4總黃酮含量的測定提取液經(jīng)超濾器超濾,濾出液(或透過液)直接用DM130樹脂柱吸附,截留下來的部分返回超濾器料液中,如此循環(huán),當(dāng)截留部分達(dá)原體積的1/10時(shí)完成超濾。用少量的無鹽水沖洗樹脂柱,再用70%乙醇洗脫,收集流出液至無色,流出液經(jīng)減壓回收乙醇,60℃減壓濃縮,真空干燥24小時(shí),粉碎,得銀杏葉提取物,稱重并以3.1的方法來測定總黃酮含量,測定結(jié)果如表5。表5數(shù)據(jù)說明了,利用膜超濾樹脂吸附單次解吸工藝制備的提取物總黃酮的含量較高(平均達(dá)25.84%),總黃酮平均收率也較高(78.83%)。3、主要結(jié)果見表13.1、關(guān)于銀杏葉提取物總黃酮含量的測定方法,目前,常用的方法有紫外可見分光光度法和高效液相色譜法。從文中表1和表2看出,紫外可見分光光度法與目前認(rèn)為可靠的方法(即銀杏葉提取物水解后以三對(duì)照品溶液用高效液相測定銀杏總黃酮含量的方法)相比,干擾因素較多,結(jié)果偏高。這可能是因?yàn)殂y杏葉提取物中含有多重二糖苷外,還含有單糖苷和甙元。若均按二糖苷計(jì)算,易導(dǎo)致結(jié)果偏高;若乘以校正因子(0.78)則結(jié)果與高效液相色譜法相近。表1數(shù)據(jù)經(jīng)校正后,與高效液相色譜法相差0.45-1.55%,基本上滿足測定要求,且使用儀器簡單、測定結(jié)果較穩(wěn)定,可作為工廠生產(chǎn)工藝的質(zhì)量控制手段。單對(duì)照品法與三對(duì)照品法相比,結(jié)果沒有明顯差別,且單對(duì)照品法線性范圍較寬、回收率好、精密度高、經(jīng)濟(jì)簡便,可以滿足銀杏葉及銀杏葉提取物總黃酮的測定。3.2、實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物(主要總黃酮)含量有多羥基易氧化成分,隨著在提取過程中的溫度升高和加熱時(shí)間的延長,顏色明顯加深,若在加熱過程中加入少量的硼砂和亞硫酸氫鈉,可能是對(duì)酚羥基的保護(hù)作用,則結(jié)果有明顯的、控制工作.(內(nèi)文見下頁)改善。因此筆者認(rèn)為,在開發(fā)銀杏制劑的時(shí)候,為了保持活性成分的穩(wěn)定,應(yīng)該對(duì)提取物中氧化因素加以考慮,在工藝過程中采取必要的抗氧化措施。3.3、有關(guān)銀杏葉提取工藝的報(bào)道不少,但不盡相同。除了不考慮這些因素外(原材料即銀杏葉來源的地區(qū)、氣候、采收季節(jié)等),本文對(duì)銀杏葉提取物的提取工藝條件和精制工藝條件,作了進(jìn)一步的探討。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)、測定、對(duì)比,確定了銀杏葉的提取工藝為:以70%乙醇為提取溶劑,用量為銀杏葉8倍量,回流