微生物的染色

試驗一顯微鏡使用及細菌,放線菌和藍細菌個體形態(tài)觀察(一)目標(1)掌握顯微鏡結(jié)構(gòu),原理,學習顯微鏡操作方法和保養(yǎng).(2)觀察細菌,放線菌和藍細菌個體形態(tài),學會生物圖繪制.(二)試驗器材(1)顯微鏡,目測微計,物測微計,擦鏡紙,香柏油,二甲苯.(2)示范片大腸桿菌小球菌藍藻等微生物的染色第1頁（二）、試驗內(nèi)容

1.顯微鏡結(jié)構(gòu)（1）.機械部分

（2）.光學部分

微生物的染色第2頁微生物的染色第3頁（2）光學部分

a.目鏡

b.物鏡:低倍物鏡高倍物鏡油鏡

物鏡性能由數(shù)值孔徑?jīng)Q定數(shù)值孔徑=n*sina/2

顯微鏡性能還依賴于物鏡分辨力

分辨力:能分辨兩點之間最小距離能力增大數(shù)值孔徑來提升分辨力.

物鏡N.A.1.25,100*,”O(jiān)I”,160/0.17,16mm----N.A.1.25數(shù)值孔徑100*放大倍數(shù)”O(jiān)I”油鏡160鏡筒長0.17要求蓋玻片厚度16mm焦距

C.聚光器

d.反光鏡

f.濾光片

微生物的染色第4頁2.顯微鏡使用和保護(1)低倍鏡使使用方法

(2)高倍鏡使使用方法

(3)油鏡使使用方法

3.目測微尺,物測微尺及其使用方法

(1)目測微尺

(2)物測微尺

(3)目測微尺標定

(4)菌體大小測量

4.細菌,放線菌和藍細菌個體形態(tài)觀察

(四)試驗匯報微生物的染色第5頁微生物的染色第6頁試驗三微生物直接計數(shù)法

(一)目標（1）明確顯微鏡計數(shù)原理．（2）學習使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)方法（二）儀器與材料顯微鏡血球計數(shù)板移液管酵母菌液（三）血球計數(shù)板結(jié)構(gòu)與計算方法（1）16＊25計數(shù)板計算公式細胞數(shù)／ｍｌ＝125小格內(nèi)細胞數(shù)＊400＊10＊1000＊稀釋倍數(shù)／125（2）25＊16計數(shù)板計算公式細胞數(shù)／ｍｌ＝80小格內(nèi)細胞數(shù)＊4＊10＊1000＊稀釋倍數(shù)／80微生物的染色第7頁四）操作步驟

（1）稀釋樣品使每格約5個細胞

（2）取潔凈血球計數(shù)板，用厚蓋玻片蓋住中央計數(shù)室，用移液管吸收少許充分搖勻待測菌液于蓋片邊緣，菌液則自行滲透計數(shù)室，5～10min即可計數(shù)

（3）將血球計數(shù)板置于載物臺上，用低倍物鏡找到小方格網(wǎng)后換用高倍鏡觀察計數(shù)

每樣品重復三次，取平均值，計算每1ml菌液中所含酵母菌數(shù)。

（五）試驗匯報

微生物的染色第8頁試驗四微生物染色目標

學習微生物涂片染色操作技術(shù),掌握微生物普通染色法(單染色法)和革蘭氏染色法試驗儀器和材料試驗步驟單染色革蘭氏染色微生物的染色第9頁涂片干燥固定染色水洗吸干鏡檢微生物的染色第10頁

取大腸桿菌和枯草桿菌芽孢桿菌(均以無菌操作)分別做涂片,干燥,固定.方法同單染色法用草酸銨結(jié)晶紫染色1min,水洗.

加革氏碘液媒染色1min,水洗斜置載玻片于一燒杯上,滴加95%酒精脫色,至流洗出酒精不展現(xiàn)紫色時,馬上用水沖凈酒精,脫色時間約20min,或視涂片厚薄而略有差異用番紅(或稱沙黃)染液染色1~2min,水洗吸干,置于顯微鏡下觀察,陽性者為紫色,陰性者為紅色革蘭氏染色關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度.如脫色過分,則陽性菌可被誤染為陰性菌;而脫色不夠時,陰性菌可被誤染為陽性菌菌齡也影響染色結(jié)果,如陽性菌培養(yǎng)時間過長,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈陰性反應微生物的染色第11頁試驗五培養(yǎng)基制備及滅菌一目標

1玻璃儀器洗滌和滅菌前準備工作

2掌握培養(yǎng)基配制方法

3會干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌操作方法二試驗材料三試驗內(nèi)容

1玻璃器皿洗滌劑包裝

A洗滌培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶等可用去污粉或肥皂，自來水沖凈。移液管用洗液浸泡在水沖凈。干燥。微生物的染色第12頁B包裝

1）培養(yǎng)皿牛皮紙包裝

2）吸管吸端塞棉花約1~1.5cm，(防細菌吸入口中，防止細管吹入)，松緊適宜。用包裝紙包移液管尖端。

3）試管和錐形瓶等管口均堵棉塞，并用牛皮紙包裹。微生物的染色第13頁2培養(yǎng)基制備

A步驟

1）配制溶液取一定容量燒杯盛入定量無菌鹽水，按培養(yǎng)基配方逐一稱取各成份，加水溶解，可加熱促進，不停攪拌以防原料在杯底燒焦。

2）調(diào)pH值測定培養(yǎng)液pH,按要求以10%HClor10%NaOH調(diào)至所需pH。

3）過濾用紗布、濾紙、棉花均可，若雜質(zhì)少可省略微生物的染色第14頁4）分裝將培養(yǎng)基分裝在試管或錐形瓶中（放置培養(yǎng)基玷污管口，防止浸濕棉塞引發(fā)雜菌污染），裝入試管量視1試管大小定，普通斜面培養(yǎng)基時為其高度1/4~1/35）斜面培養(yǎng)基制作將裝有瓊脂培養(yǎng)基已滅菌試管趁熱取出，斜置于木棒上，使其斜面長度為試管1/3~1/2，代培養(yǎng)基凝固后即成斜面微生物的染色第15頁B營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備1）培養(yǎng)基配方：牛肉膏0.75g，蛋白胨1.5g，氯化鈉0.75g，瓊脂3g，蒸餾水150ml，pH7.6。0.1Mpa下滅菌20min.2）操作：a取300ml燒杯一個，裝150ml蒸餾水。

b在藥品天平上一次稱取配方中各成份，水中溶解，帶待瓊脂完全溶解后停頓加熱，補充水分，用10%NaOH調(diào)pH=7.6，省略過濾，培養(yǎng)基分裝五支試管中，余入250ml錐形瓶，塞上棉塞，包炸好待滅菌3無菌水制備1）取250ml錐形瓶裝90ml蒸餾水，賽棉塞，包扎，待滅菌2）取5支18mm*18mm試管，分裝9ml蒸餾水………4滅菌殺死全部微生物營養(yǎng)細胞和它們芽孢或孢子微生物的染色第16頁滅菌方法過濾除菌，化學藥品消毒，利用酚、甲醛等是細菌蛋白質(zhì)變性滅菌；高溫，紫外線等物理方法加熱滅菌是主要：干熱滅菌，高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）。后者在121oC滅菌15~30min,效果好。1）干熱滅菌法：用于培養(yǎng)皿等玻璃儀器。包裝好上述物品放入恒溫箱中，160oC維持2h，旋鈕調(diào)至零，到50oC可取2）高壓蒸汽滅菌：微生物試驗所需儀器培養(yǎng)基，皆可用高壓滅菌鍋滅菌微生物的染色第17頁2）滅菌操作過程

A先加水，放物品，蓋鍋蓋，對稱擰緊螺栓，防漏氣。

B加熱，并開排氣閥，冒熱氣3~5min后關。到所需壓力計時，達滅菌時間后停頓加熱

C壓力為零開排氣閥，取物

D將滅菌后培養(yǎng)基于37oC恒溫箱24h，作無菌培養(yǎng)，若無菌生長，可保留備用。微生物的染色第18頁試驗六微生物純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)一目標要求掌握倒平板方法和幾個分離純化微生物基本要求二儀器材料三操作方法及步驟

1微生物純種分離及培養(yǎng)：稀釋平板法和平板劃線法

1）稀釋平板法

a取樣用無菌錐形瓶取定量會活性污泥

b稀釋水樣將一瓶90毫升和5管9毫升無菌水按10-1

至10-6依次編號。無菌條件下用10ml移液管取10ml水樣于第一瓶90ml無菌水中，搖勻即得10-1濃度菌液。移液管吹洗3次微生物的染色第19頁用1ml無菌移液管取1ml10-1濃度菌液于9ml無菌水中搖勻。同法，依次稀釋至10-6C平板制作將10套無菌培養(yǎng)皿編號10-410–510-6按次序分別取0.5ml菌液于對應培養(yǎng)皿（吸前移液管吹使其混勻）。同時加熱瓊脂培養(yǎng)基，熔化，冷至45oC時，注10~15ml入培養(yǎng)皿。馬上蓋蓋，混勻，冷卻后即成平板。將培養(yǎng)基倒置于30恒溫箱中培養(yǎng)，48h后觀察結(jié)果微生物的染色第20頁（2）平板劃線分離法

a制作:將熔化冰涼至50oC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

10~15ml

導入無菌培養(yǎng)皿，凝固成平板

b劃線：以無菌操作，接種環(huán)挑污泥于在平板上劃線，蓋蓋，倒置于30oC恒溫箱培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果2其它接種方法操作1）斜面接種技術(shù)A貼標簽B點燃酒精燈C將一支斜面菌種和一支待接種斜面培養(yǎng)基放左手，拇指壓住兩試管，中指于其間，斜面向上，管口齊平。D接種環(huán)滅菌微生物的染色第21頁微生物的染色第22頁E將棉花拔出，試管口微繞火焰。用接種環(huán)快速移菌種于另一試管底部，再接種環(huán)上有底部向上畫曲線。接種環(huán)滅菌。2）液體接種由斜面基接種到液體培養(yǎng)基。用接種環(huán)將菌種全送入液體培養(yǎng)基，塞棉花，轉(zhuǎn)動使其混勻。3）液體培養(yǎng)基中菌種被接入液體培養(yǎng)基用無菌移液管自菌種管吸收菌液接種到另一液體培養(yǎng)基中賽好棉塞即可4）穿刺接種將斜面培養(yǎng)基接種到固體或半固體深層培養(yǎng)基自中心刺入，直到管底，但不穿透，并沿穿刺路徑拔出，易于觀察。微生物的染色第23頁試驗七純培養(yǎng)菌中菌體、菌落形態(tài)觀察一目標觀察菌形態(tài)及菌落特征，經(jīng)過革氏染色了解活性污泥有哪些微生物組成。二儀器材料三試驗內(nèi)容與方法1菌落形態(tài)和菌體染色及其形態(tài)觀察A接種斜面培養(yǎng)基B菌落形態(tài)特征觀察酵母菌菌落圓形，大小靠近細菌，光滑，質(zhì)地軟，多為白色和紅色。放線菌洛硬度大，干致密，與基質(zhì)結(jié)合緊。酶菌菌落呈絨狀或棉狀，能擴散生長，疏松。微生物的染色第24頁在液體培養(yǎng)基上觀察混濁度，有沒有沉淀，液體表面生膜與否，膜形狀等；在斜面培養(yǎng)基上，觀察菌落生長旺盛程度，形狀，顏色，及光澤等在穿刺接種時看菌落在基質(zhì)表面情況，菌落延伸及是否液化培養(yǎng)基和液化情況。觀察時繪出菌落形態(tài)特征圖3）微生物個體形態(tài)觀察觀察各種微生物菌落形態(tài)后，革氏染色，鏡檢，繪其形態(tài)圖。2細菌，放線菌，酵母菌及霉菌菌落特征比較四試驗匯報五思索題微生物的染色第25頁微生物的染色第26頁試驗八水中大腸菌群檢測目標

學習水中大腸菌群檢測原理和方法儀器和材料樣品培養(yǎng)基染料其它原理操作方法與步驟多管發(fā)酵法濾膜法微生物的染色第27頁大腸菌系以大腸埃希氏菌為主需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌,在世界范圍內(nèi)370c生長時,能于48h內(nèi)發(fā)酵乳糖使產(chǎn)酸產(chǎn)氣.主要包含埃希氏菌屬,腸桿菌屬,克雷伯氏菌屬等.因為其在水體中存在數(shù)目與腸道致病菌呈一定正相關,抵抗力也略強,且易于檢驗等特點,在水質(zhì)檢測中常將其作為水體受糞便污染指標,如我國生活飲用水衛(wèi)生標準中即要求1L水樣中大腸菌群數(shù)不超出3個.大腸菌群也稱為糞便污染指示菌.蘇檢驗方法有我管發(fā)酵法及濾膜法兩種.多管發(fā)酵法可適合用于各種水樣,試驗周期較長;濾膜法則適合用于雜技較少水樣,尤其適合用于自來水廠作為常規(guī)監(jiān)測之用.微生物的染色第28頁

取水樣自來水樣采集河湖、井水、海水水樣采集水樣處置初步發(fā)酵試驗復發(fā)酵試驗微生物的染色第29頁微生物的染色第30頁準備工作濾膜滅菌濾膜過濾器安裝

過濾水樣

觀察結(jié)果挑取符合大腸菌群菌落特征菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。將鏡檢驗員革蘭氏服性、無芽孢桿菌菌落再接種一支乳糖蛋白胨發(fā)酵管，經(jīng)370c培養(yǎng)24h，產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者即為大腸菌群陽性計算1L水樣中大腸菌群數(shù)=