蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法

蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第1頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品蛋白含量原理和操作步驟;深入熟練分光光度計(jì)原理和操作方法;掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和使用。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第2頁(yè)雙縮脲（NH3CONHCONH3）：凡含有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接肽鍵，都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。Folin—酚試劑法（Lowry法）

Folin—酚試劑中磷鉬酸鹽被蛋白質(zhì)中酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭混合物），在一定條件下，蘭色深度與蛋白量成正比。該法靈敏度是雙縮脲法100倍.1976年由Bradford建立考馬斯亮蘭法:染料主要是與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（尤其是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定吸光度值，與蛋白質(zhì)濃度成正比，靈敏度高比Lowry法約高四倍蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第3頁(yè)試驗(yàn)原理1976年由Bradford建立考馬斯亮藍(lán)法，是依據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合原理設(shè)計(jì)。這種方法是當(dāng)前靈敏度最高蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一.考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在游離狀態(tài)下呈棕紅色，在酸性溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變?yōu)樗{(lán)色，使染料最大吸收峰位置，由465nm變?yōu)?95nm。在595nm測(cè)定吸光度，與蛋白質(zhì)濃度成正比。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第4頁(yè)CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第5頁(yè)

Bradford法突出特點(diǎn):(1)靈敏度高。其最低檢測(cè)蛋白質(zhì)含量可達(dá)1mg，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料相結(jié)合后產(chǎn)生顏色改變很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高吸光系數(shù)。(2)測(cè)定快速，簡(jiǎn)練，完成一個(gè)樣品測(cè)定，只要5分鐘左右。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合過程，大約只要2分鐘,其顏色在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定（在5-20分鐘之間，穩(wěn)定性最好）(3)干擾物質(zhì)少。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第6頁(yè)缺點(diǎn):(1)各種蛋白質(zhì)中精氨酸和芳香族氨基酸含量不一樣，所以不一樣蛋白質(zhì)時(shí)有較大偏差；(2)有一些去污劑等物質(zhì)干擾此法測(cè)定；(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計(jì)算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)濃度。

此方法靈敏度比紫外吸收法高10-20倍。凱氏定氮法比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)作為其它方法標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第7頁(yè)器材與試劑

可見光分光光度計(jì)試管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA）配置考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭，溶于50ml95%乙醇后，再加入120ml85%磷酸，用水稀釋至1升。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第8頁(yè)(三)操作方法(1)取6支試管編號(hào)，1支作空白，4支加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1支留作未知樣品。分別加入各種試劑：試管編號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（mL)00.20.40.60.8待測(cè)樣品（mL)10.9%Nacl（mL)10.80.60.40.20染液（mL)444444蛋白質(zhì)濃度（ug/mL）020406080？蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第9頁(yè)(2)加完試劑混勻，2-5分鐘后即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處光吸收值，空白對(duì)照為1號(hào)管。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為橫坐標(biāo)，用吸光值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)，作圖，即得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)測(cè)出未知樣品吸收值，即可查出樣品蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第10頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作坐標(biāo)紙法電腦軟件法蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第11頁(yè)

(1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇普通應(yīng)能包含待測(cè)樣品可能最低與最高值，可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加，并應(yīng)與被測(cè)液一樣條件下顯色測(cè)定。

(2)標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定：在比色時(shí)，讀取光密度最少讀2-3次，求其平均值，以降低儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生誤差。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖繪制：普通常見是光密度一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。①用普通方格紙作圖。以橫軸為濃度，縱軸為光密度，普通濃度全距占用了多少格，光密度全距也應(yīng)占用相同格數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作-坐標(biāo)紙蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第12頁(yè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長(zhǎng)，光密度位置向右延長(zhǎng)、交點(diǎn)為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合朗伯比爾定律，則經(jīng)過原點(diǎn)直線。②若各點(diǎn)不在一直線，則可經(jīng)過原點(diǎn)，盡可能使直線經(jīng)過更多點(diǎn)，使不在直線上點(diǎn)盡可能均勻分布在直線兩邊。③繪制完成以后，在座標(biāo)紙上注明試驗(yàn)項(xiàng)目標(biāo)名稱，比色計(jì)型號(hào)和儀器編號(hào)、單色光波長(zhǎng)、日期等。④普通作2-3次以上平行，重復(fù)性良好曲線方可。⑤繪制好標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測(cè)定相同物質(zhì)時(shí)使用。當(dāng)更換儀器、移動(dòng)儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有顯著改變時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第13頁(yè)電腦作圖-Excel為例首先，將數(shù)據(jù)整理好輸入Excel，并選取完成數(shù)據(jù)區(qū)，并點(diǎn)擊圖表向?qū)?；點(diǎn)擊圖表向?qū)Ш髸?huì)運(yùn)行圖表向?qū)б韵铝袌D，先在圖表類型中選“XY散點(diǎn)圖”，并選了圖表類型“散點(diǎn)圖”

點(diǎn)擊“下一步”，假如發(fā)覺圖不理想，就要仔細(xì)察看是否數(shù)據(jù)區(qū)選擇有問題，假如有誤，能夠點(diǎn)擊“系列”來更改.蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第14頁(yè)完成了散點(diǎn)圖，現(xiàn)在需要依據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其實(shí)這很簡(jiǎn)單，先點(diǎn)擊圖上標(biāo)準(zhǔn)值點(diǎn)，然后按右鍵，點(diǎn)擊“添加趨勢(shì)線”。點(diǎn)擊趨勢(shì)線（也就是咱們說標(biāo)準(zhǔn)曲線）然后按右鍵，選趨勢(shì)線格式，在顯示公式和顯示R平方值（直線相關(guān)系數(shù)）前點(diǎn)一下，勾上。再點(diǎn)確定。公式和相關(guān)系數(shù)都出來了。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第15頁(yè)蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法第16頁(yè)四.注意事項(xiàng)（1）假如測(cè)定要求很嚴(yán)格，能夠在試劑加入后5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵龠@段時(shí)間內(nèi)顏