蛋白質(zhì)相互作用多種方法

蛋白質(zhì)互相作用多種辦法第1頁P(yáng)roteininteraction：twoormoreproteins(sameordifferent)interactorformcomplex第2頁人類蛋白質(zhì)組相用

有某些蛋白質(zhì)能夠以單體形式發(fā)揮作用，不過大部分蛋白質(zhì)都是和伴侶分子或是與其他蛋白質(zhì)一起發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)有關(guān)知識(shí)及研究蛋白質(zhì)互相作用必要性第3頁蛋白質(zhì)互相作用：本身具有生物學(xué)意義：這樣互相作用在生物體中是起什么作用發(fā)展技術(shù)：利用這樣互相作用發(fā)明出某些人為作用第4頁利用生物信息學(xué)辦法由繁入簡(jiǎn)試驗(yàn)分析辦法由簡(jiǎn)入繁第5頁整體系統(tǒng)部分單體第6頁酵母蛋白質(zhì)互相作用聯(lián)系圖人蛋白質(zhì)互相作用聯(lián)系圖第7頁研究蛋白質(zhì)互相作用目標(biāo)是發(fā)覺并明確其互相作用生物學(xué)意義蛋白質(zhì)互相作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)互相作用關(guān)鍵“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反應(yīng)了遺傳這樣一種本質(zhì)現(xiàn)象可研究對(duì)象合適研究辦法第8頁研究蛋白質(zhì)互相作用需要微觀和宏觀結(jié)合象與象一部分第9頁

研究蛋白質(zhì)互相作用意義1、蛋白質(zhì)間互相作用是細(xì)胞生命活動(dòng)基礎(chǔ)。2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用主體。蛋白質(zhì)互相作用是發(fā)揮其功能主要活動(dòng)。第10頁穩(wěn)定互相作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合體

（proteincomplex）瞬時(shí)互相作用（enzyme-substrate）生物學(xué)效應(yīng)穩(wěn)定互相作用與瞬間互相作用共同組成蛋白質(zhì)互相作用內(nèi)涵。第11頁研究蛋白質(zhì)互相作用是為了研究對(duì)應(yīng)生物學(xué)功能確定研究目標(biāo)尋找互相作用建立互相作用網(wǎng)絡(luò)和功能體系第12頁從蛋白質(zhì)互相作用到生物學(xué)功能。利用蛋白質(zhì)直接互相作用，發(fā)覺互相作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用生物學(xué)意義。容易犯錯(cuò)誤：研究一大堆蛋白互相作用，卻不懂得這些互相作用有什么生物學(xué)意義。從生物學(xué)功能到蛋白質(zhì)互相作用。通過變化生物學(xué)現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間遺傳互相作用，深入研究有關(guān)蛋白質(zhì)互相作用。容易犯錯(cuò)誤：找到了平行變化不有關(guān)蛋白質(zhì)。第13頁免疫共沉淀噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)基因外抑制子合成致死篩選分子生物學(xué)辦法Pulldown試驗(yàn)遺傳學(xué)辦法蛋白質(zhì)互相作用研究辦法生物物理學(xué)辦法串聯(lián)親和純化第14頁

免疫共沉淀

（co-immunoprecipitation，CO-IP）

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間互相作用被保存了下來。假如用蛋白質(zhì)X抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)Y也也許沉淀下來。蛋白質(zhì)Y沉淀是基于與蛋白質(zhì)X物理性互相作用，稱為免疫共沉淀。

第15頁Westernblot：變性抗原，主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)存在是否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于判定不一樣蛋白質(zhì)間互相作用。多采取非離子變性劑（NP40或TritonX-100)第16頁免疫共沉淀檢測(cè)蛋白質(zhì)原理和常見問題YABAYBY非特異性第17頁試驗(yàn)過程第18頁試驗(yàn)過程（1）加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；（2）取少許裂解液以備Westernblot分析，剩下裂解液加1μg對(duì)應(yīng)抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C遲緩搖晃孵育過夜；（3）取10μlproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；（4）將預(yù)處理過10μlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜細(xì)胞裂解液中4°C遲緩搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連；（5）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；（6）SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。第19頁實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵1、試驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體性質(zhì)。抗體不一樣和抗原結(jié)合能力也不一樣，尤其是多抗特異性是問題。2、為避免蛋白分解、修飾，溶解抗原緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行試驗(yàn)。3、考慮抗體/緩沖液百分比。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘余在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。第20頁主要用于：兩種感愛好蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)存在互相作用；也用于判定一種特定蛋白質(zhì)未知互相作用蛋白。

注意：1要求在一系列清洗過程中保持蛋白質(zhì)復(fù)合體不變。由于出現(xiàn)假陽性概率比較高。

2設(shè)置對(duì)照：在對(duì)照組中使用對(duì)照抗體，以缺失目標(biāo)蛋白細(xì)胞系作為陰性對(duì)照等等。第21頁Westernblot1、電轉(zhuǎn)移效率2、PVDF膜充足浸潤3、轉(zhuǎn)移液中有太多SDS4、膜損壞5、轉(zhuǎn)移時(shí)膠和膜沒有完全接觸6、抗體問題7、抗體濃度太高或太低8、還原性物質(zhì)存在9、封閉不充足第22頁長(zhǎng)處：1、互相作用蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾，處于天然狀態(tài)；2、蛋白互相作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行，能夠避免人為影響；3、能夠分離得到天然狀態(tài)互相作用蛋白復(fù)合物。第23頁缺陷：1、也許檢測(cè)不到低親和力和瞬間蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)互相作用；2、兩種蛋白質(zhì)結(jié)合也許不是直接結(jié)合，而也許有第三者在中間起橋梁作用；3、如用westernblot檢查，必須在試驗(yàn)前預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)抗體，若預(yù)測(cè)不正確，試驗(yàn)就得不到成果，辦法本身具有冒險(xiǎn)性，敏捷度不如親和色譜高。第24頁

GSTpull-down技術(shù)

1988年Smith等利用GST融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白,從此GST融合蛋白在研究蛋白質(zhì)互相作用領(lǐng)域得到極大推廣(His也常用)。此辦法是一種行之有效驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)體外試驗(yàn)技術(shù)。還應(yīng)當(dāng)在體內(nèi)用單獨(dú)辦法，如免疫共沉淀加以證明。

第25頁靶蛋白X基因亞克隆到帶有GST基因原核體現(xiàn)載體中，并在細(xì)菌中體現(xiàn)GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探針、誘餌蛋白)掛到帶有GST底物Sepharosebeads上，然后把另一種含目標(biāo)蛋白質(zhì)（捕捉蛋白）溶液加入其中。由于谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白，如發(fā)生互相作用則形成復(fù)合物：GST-X-Y，沉淀搜集下來，洗脫非特異結(jié)合蛋白后采取SDS判定與誘餌蛋白質(zhì)互相作用蛋白質(zhì)。原理第26頁GST-Pulldown

Assay右：對(duì)照，中間翻轉(zhuǎn)混合時(shí)發(fā)生互相作用，膠上只與GST融合蛋白結(jié)合而不與GST結(jié)合特異性條帶表達(dá)新互相作用蛋白。第27頁GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution第28頁GSTpulldownGSTfusionprotein不夠純，用作bait會(huì)產(chǎn)生太多非特異性蛋白質(zhì)污染。第29頁檢測(cè)GST融合蛋白與靶蛋白互相作用：1、放射性標(biāo)識(shí)融合蛋白：迅速簡(jiǎn)單易行2、抗GST抗體檢測(cè)3、生物素標(biāo)識(shí)融合蛋白：沒有放射性，但也許對(duì)探針蛋白和其他蛋白互相作用有影響。第30頁應(yīng)用：一確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間新互相作用；一是判定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用。第31頁特點(diǎn)：比較簡(jiǎn)便，假如用抗GST抗體檢測(cè)或生物素標(biāo)識(shí)融合蛋白避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)，在蛋白質(zhì)互相作用研究中有很廣泛應(yīng)用。融合蛋白具有高通量性、高選擇性特點(diǎn)，由于融合蛋白多樣性以及體現(xiàn)系統(tǒng)多樣性(如細(xì)菌、果蠅、哺乳動(dòng)物)，該辦法能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中互相作用。

注意：該辦法成功應(yīng)用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性重組融合蛋白，且無過度降解（探針蛋白變成不一樣降解產(chǎn)物混合物）和不溶，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白干擾。第32頁串聯(lián)親和純化（TAP）近年來質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，其功能強(qiáng)大且敏捷度高，常用來判定互相作用蛋白質(zhì)復(fù)合體或復(fù)合體亞基，但一般難以取得足夠量純化蛋白質(zhì)復(fù)合體，成為質(zhì)譜在這方面應(yīng)用一種限速步驟。1999年Rigaut（德國）等人共同提出了一套分離復(fù)合蛋白新辦法—串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具標(biāo)準(zhǔn)親和純化（能夠得到高純度地拷貝數(shù)蛋白質(zhì)復(fù)合體）和免疫共沉淀（用于特異性標(biāo)識(shí)蛋白與親和柱之間互相作用）兩種生化辦法長(zhǎng)處，為蛋白質(zhì)復(fù)合體分離判定提供了一條新途徑。

第33頁適用：研究蛋白質(zhì)復(fù)合體中多種蛋白質(zhì)間互相作用，尤其適用于研究蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下互相作用第34頁首先通過基因工程給被分離純化蛋白一端加一種TAP標(biāo)簽，該標(biāo)簽由IgG結(jié)合構(gòu)造域(ProtA)及一種鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(CBP)組成，構(gòu)造域與多肽之間由一種TEV蛋白酶切位點(diǎn)隔開。原理辦法

第35頁第36頁

1、基因重組將細(xì)胞內(nèi)源性目標(biāo)蛋白基因置換為帶有TAP標(biāo)簽基因，溫和裂解細(xì)胞，獲取細(xì)胞抽提物。

2、將抽提物加入IgG親和柱，TAP標(biāo)簽ProtA端會(huì)與IgG形成強(qiáng)結(jié)合，在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結(jié)合物和雜蛋白。

試驗(yàn)流程第37頁3、具有TEV蛋白酶洗脫夜將蛋白質(zhì)復(fù)合體切割下來。在鈣離子參與下，被切割下來帶有CBP蛋白質(zhì)復(fù)合體與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合，充足洗脫，就能夠深入清除非特異作用蛋白質(zhì)雜質(zhì)，最后純化出高純度目標(biāo)蛋白復(fù)合體。4、通過串聯(lián)親和純化目標(biāo)蛋白，通過SDS或者雙向電泳分離之后，找出與目標(biāo)蛋白互相作用蛋白質(zhì)，采取質(zhì)譜分析辦法對(duì)其進(jìn)行分析判定。第38頁Mammalian

Tap-tag-LC-MS/MS

method第39頁

TAP長(zhǎng)處加工和修飾過蛋白能夠作誘餌，互相作用發(fā)生在天然環(huán)境和細(xì)胞部位，一次操作能夠分離和分析多組分復(fù)合物，得到廣泛應(yīng)用，由于TAP標(biāo)簽高度特異性以及采取兩步洗脫純化法，在純化過程中不需要強(qiáng)烈沖洗，因此能夠更加好地保持較不穩(wěn)定蛋白質(zhì)復(fù)合物，并且非特異蛋白量也會(huì)很低，這是一步純化法所不能比擬?？朔穗p雜交篩選步驟復(fù)雜、假陽性成果較多、難于量化、不能滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究需要缺陷。第40頁TAP缺陷更傾向于高豐度和穩(wěn)定互相作用，許多低親和力、瞬時(shí)和依賴特殊細(xì)胞環(huán)境互相作用也許檢測(cè)不到。另外，TAP必須采取能產(chǎn)生體現(xiàn)TAP標(biāo)簽蛋白，這種標(biāo)簽蛋白體現(xiàn)最佳接近生理水平，因此最佳將帶標(biāo)簽基因用天然啟動(dòng)子體現(xiàn)。但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，天然啟動(dòng)子體現(xiàn)標(biāo)簽蛋白是非常困難，其體現(xiàn)水平不一樣于無標(biāo)簽內(nèi)源蛋白，由非生理水平誘餌蛋白而產(chǎn)生假陽性。第41頁親和純化（affinitypurification

）純化：

抗體

Epitope-tag：flag,myc,HA,V5,GST…

核酸Pull-downImmunoprecipitationTAP(TandemAffinityPurification)

第42頁酵母雙雜交（Yeasttwo-hybrid

）

1989年Field等發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了酵母生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子GAL4具有兩個(gè)構(gòu)造域,DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD),將已知基因(誘餌基因)和靶基因或具有靶基因cDNA分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上,將這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,若BD結(jié)合誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合靶蛋白或文庫中某些cDNA編碼蛋白互相作用、彼此間結(jié)合時(shí),則會(huì)造成位于側(cè)翼BD與AD在空間上接近,展現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子完全活性,啟動(dòng)下游報(bào)告基因如His及LacZ等基因體現(xiàn),從而在特定缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。一、酵母雙雜交系統(tǒng)基本原理第43頁典型真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都具有二個(gè)不一樣構(gòu)造域:DNA結(jié)合構(gòu)造域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域(transcription-activatingdomain)。前者可識(shí)別DNA上特異17bp長(zhǎng)序列（UAS），并使轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域定位于所調(diào)整基因上游，轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體其他成份作用，啟動(dòng)它所調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄。第44頁第45頁His,β-gal第46頁BD和AD功能上互相獨(dú)立又互相依賴，只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整轉(zhuǎn)錄因子活性第47頁據(jù)此可將兩個(gè)待測(cè)蛋白（X和Y）分別與這兩個(gè)構(gòu)造域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y），并共體現(xiàn)于同一種酵母細(xì)胞內(nèi)，假如兩個(gè)待測(cè)蛋白間能互相作用，就會(huì)通過待測(cè)蛋白橋梁作用使AD與BD形成一種完整轉(zhuǎn)錄激活因子，并激活對(duì)應(yīng)報(bào)告基因體現(xiàn)。通過對(duì)報(bào)告基因檢測(cè)就可很容易懂得待測(cè)分子間是否發(fā)生了互相作用。深入用已知蛋白X作為誘餌，分離取得與之互相作用蛋白質(zhì)Y及其編碼序列。第48頁His,β-gal第49頁二、酵母雙雜交系統(tǒng)組成與BD融合蛋白體現(xiàn)載體誘餌蛋白baitprotein與AD融合蛋白體現(xiàn)載體靶蛋白preyprotein帶有多種報(bào)告基因宿主菌株

HIS3、URA3、LacZ和LEU2等第50頁報(bào)告基因LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)第51頁第52頁

X-β-半乳糖苷酶藍(lán)白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD第53頁Yeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）應(yīng)用

發(fā)覺新互相作用蛋白質(zhì)

判定和分析已有蛋白質(zhì)間互相作用

確定蛋白質(zhì)間互相作用功能基團(tuán)第54頁lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ第55頁發(fā)覺新互相作用蛋白質(zhì)BDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫Marker2第56頁文庫篩選步驟1、將待測(cè)基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。2、將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報(bào)告基因啟動(dòng)子酵母細(xì)胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化酵母。3、再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中。4、通過報(bào)告基因功能篩選互相作用蛋白。第57頁確定蛋白質(zhì)間互相作用功能基團(tuán)ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白第58頁判定和分析已有蛋白質(zhì)間互相作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：互相作用白：不互相作用第59頁序列分析

從酵母中分離質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化E.coli從大腸桿菌中提取質(zhì)粒并測(cè)序在數(shù)據(jù)庫中比對(duì)所測(cè)定序列與已知蛋白同源性第60頁酵母雙雜交測(cè)序成果酵母雙雜交得到陽性克隆子質(zhì)粒通過DNA測(cè)序，由NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST檢索cDNA編碼蛋白質(zhì)舉例第61頁測(cè)序成果查詢過程cDNA序列NCBIBLASTNucleotidemegablastsearchformatresults第62頁Blast舉例第63頁Results舉例第64頁長(zhǎng)處

1、迅速取得互相作用蛋白基因2、只需單一步驟質(zhì)粒構(gòu)建3、檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在一定程度上

代表細(xì)胞內(nèi)真實(shí)情況。4、作用信號(hào)是在融合基因體現(xiàn)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子作用而給出,省去了純化蛋白質(zhì)繁瑣步驟第65頁5、檢測(cè)成果能夠是基因體現(xiàn)產(chǎn)物積累效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間薄弱或臨時(shí)互相作用。6、酵母雙雜交系統(tǒng)可采取不一樣組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫,能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不一樣亞細(xì)胞部位及功能蛋白。7、通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定酶使信號(hào)放大。同步,酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白體現(xiàn)等檢測(cè)辦法均很敏感第66頁不足1、雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間互