PCR分子診斷技術(shù)

PCR分子診斷技術(shù)

王洋2016.12.27內(nèi)容PCR技術(shù)的概念及發(fā)展簡史PCR反應(yīng)的基本成分PCR基本原理和反應(yīng)過程實時熒光定量PCR檢測基本原理和方法PCR技術(shù)的應(yīng)用、臨床意義及發(fā)展趨向臨床PCR檢驗的實驗室管理PCR技術(shù)的概念及發(fā)展簡史PCR概念PCR的由來是Polymerasechainreaction的首個字母的組合，是聚合酶鏈式反應(yīng)的簡稱，是一項體外擴增DNA序列的技術(shù)。PCR發(fā)展簡史

1985年美國科學(xué)家KaryMullis在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，從此PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的認同，并與1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。1

1988年saiki從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，此酶能耐高溫，在熱變性中不會失活，從而解決了PCR操作技術(shù)中酶鈍化為實際操作而帶來的困擾，極好的提高了PCR的擴增效率，從此，此酶被命名為

TaqDNA聚合酶。

自PCR方法不斷改進后，現(xiàn)PCR方法已衍生幾十種之多，目前實時熒光定量PCR方法已被臨床廣泛應(yīng)用，不僅可以用于定性檢測而且可以確定原始樣品含量。廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、微生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)研究中，由于PCR方法有著極強的實用性，因此仍會被不斷完善，進一步在生命科學(xué)研究中發(fā)揮更好的作用。

PCR反應(yīng)的基本成分

模板

是待擴增序列的核酸，包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、mRNA和細胞等都可以作為PCR反應(yīng)的模板。

特異性引物

是與靶DNA3’和5’端特異性結(jié)合的寡核苷酸片段，是決定PCR特異性的關(guān)鍵。當每條引物都能特異性地與模板DNA中的靶序列復(fù)性形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，才能保證其特異性。

熱穩(wěn)定DNA聚合酶

是PCR技術(shù)實現(xiàn)自動化的關(guān)鍵，是從嗜熱古細菌中最早分離出的，最常用的DNA聚合酶。2

脫氧核甘三磷酸（dNTP）

標準PCR反應(yīng)體系中包含4種等物質(zhì)的量濃度的脫氧核甘三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。

二價陽離子

所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，常用的是Mg2＋，Mn2+

緩沖液

維持PCR反應(yīng)體系中的PH，使用Tris－Cl緩沖液。

一價陽離子

標準的PCR緩沖液中包含50mmol／L的KCl，有益于DNA片段的擴增。

PCR的基本反應(yīng)原理和特點

PCR原理

PCR基本過程類似于DNA的天然復(fù)制，特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。整個過程由變性－退火－延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

變性：模版DNA經(jīng)加熱至94℃左右，雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，為與引物結(jié)合做準備。

退火：DNA加熱變性成單鏈后，當溫度降至一定程度（55℃左右）時，引物即與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。

延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP為原料，按A－T、C－G堿基配對與半保留復(fù)制原則，合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈。3

重復(fù)上述變性－退火－延伸的循環(huán)過程，每一循環(huán)獲得的“半保留半復(fù)制”鏈繼續(xù)成為下次循環(huán)的模板。通常一個完整的循環(huán)時間需要2-4min，2-3h就能將靶核酸放大幾百萬倍。

一般臨床擴增目的核酸將循環(huán)次數(shù)設(shè)定在40-50個循環(huán)之間，以此達到擴增目的。PCR的特點

特異性高

包括：引物的特異性及延伸時，堿基配對的正確性；TaqDNA聚合酶的穩(wěn)定性。

靈敏度高PCR擴增產(chǎn)物的量以指數(shù)方式增長，能在2-3h內(nèi)，將1個靶分子DNA擴增至10億個分子，因此一個反應(yīng)體系中如有2-3個靶分子，則可成功檢測出目的基因。

簡便快速

通過PCR技術(shù)可在2-4小時之內(nèi)獲得目的基因，為臨床患者提供快速準確的確診檢測。

實時熒光定量PCR法

概念

指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強弱的變化來及時分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過與已知量的標準品進行比較，實現(xiàn)實時定量的方法。反應(yīng)過程

在實時熒光定量PCR反應(yīng)過程中，對整個過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著反應(yīng)時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式“S”增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終不再以指數(shù)方式生產(chǎn)模板，而進入“平臺期”。4

實時熒光定量PCR法

熒光閾值和循環(huán)閾值

熒光閾值（threshold）

概念：是在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個熒光強度標準，即PCR擴增產(chǎn)物量的標準。循環(huán)閾值（cyclethresholdvalue，Ct）

概念：PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。特點

操作簡便、快速、高效、較高的靈敏性及特異性、污染性低。

PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用、意義

及發(fā)展趨向

PCR臨床應(yīng)用

感染性疾病的診斷與治療

包括：病毒：肝炎病毒、HIV、HPV、流感病毒等

細菌：結(jié)核桿菌、TP、UU、CT、NG等

寄生蟲：弓形蟲、瘧原蟲等

遺傳性疾病的診斷及預(yù)防

包括：染色體疾病、血紅蛋白病、血友病、遺傳性耳聾、糖尿病等

腫瘤標志物的監(jiān)測與診斷

包括：乳腺癌、腸癌、白血病等

個體化用藥的臨床指導(dǎo)

包括：藥物作用靶點相關(guān)基因、藥物代謝酶基因、藥物副作用相關(guān)基因等PCR臨床意義：

快速確診是否有病毒、細菌等致病性微生物感染；

了解體內(nèi)感染的數(shù)量、復(fù)制程度，是否具有傳染性；

對臨床治療的用藥監(jiān)測，有無好轉(zhuǎn)或耐藥情況，如產(chǎn)生耐藥，如何指導(dǎo)用藥種類及計量等。PCR的發(fā)展趨勢

隨著臨床分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，DNA測序技術(shù)已逐漸成熟，可為臨床疾病的分子診斷提供更精確的判定依據(jù)，現(xiàn)由一代測序技術(shù)已發(fā)展至三代測序技術(shù)，為醫(yī)療領(lǐng)域帶來更方便、快捷的檢測手段。

臨床PCR檢驗的實驗室管理

PCR實驗室的布局設(shè)計臨床PCR檢驗標本的采集、運送PCR核酸檢測的工作流程PCR污染的產(chǎn)生及預(yù)防措施實時熒光PCR擴增儀簡介臨床PCR檢驗的質(zhì)量控制實驗室質(zhì)量管理體系的建立

PCR實驗室的布局設(shè)計

原則：各區(qū)獨立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作。區(qū)域劃分：試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。注意事項：1.每個區(qū)域應(yīng)分開獨立，各區(qū)域設(shè)計緩沖間。不能將各區(qū)域的設(shè)施物品交叉使用，不易使用中央空調(diào)、注意傳遞窗的設(shè)置避免發(fā)生區(qū)域間空氣直通的現(xiàn)象。2.實驗室內(nèi)空氣在PCR實驗室專用走廊內(nèi)應(yīng)按照試劑準備區(qū)－標本制備區(qū)－擴增區(qū)－產(chǎn)物分析區(qū)單一方向流動，避免空氣反向流動，將PCR后區(qū)的擴增產(chǎn)物帶入前區(qū)的潔凈區(qū)域。3.各區(qū)域應(yīng)配置專用的工作用品、紫外燈及儀器設(shè)備等物品。

臨床PCR檢驗標本的采集、運送

標本采集

采集時間（選擇最具有臨床感染特點的時間點，防止臨床出現(xiàn)假陰性結(jié)果）

標本類型和采集量（針對不同病原體的特性，選擇正確的標本類型及采集量）

采樣質(zhì)量的評價（指標本的質(zhì)量是否符合檢測要求，如血液標本有無溶血、脂血，分泌物標本有無采集到足夠的脫落細胞等）

采樣容器的選擇（一般應(yīng)選擇無菌密封的容器，血液標本需選擇含EDTA、枸櫞酸鹽抗凝劑的容器，防止肝素納抑制核酸物質(zhì)的提?。吮具\送及保存核酸為DNA的標本在室溫下建議8h內(nèi)送至實驗室檢測，2-8可保存3d；RNA的標本4h內(nèi)送至實驗室檢測，如不能及時檢測應(yīng)立即分離血清－20℃存放（1-2周）。分泌物室溫下8h內(nèi)送檢，如不能及時檢測，應(yīng)使用生理鹽水洗滌處理后保留沉淀于－80℃保存。檢測完畢的陽性標本應(yīng)分離血清至－80℃冰箱存放。

PCR核酸