一種B細胞擴增用重組蛋白CD40L及其使用方法與流程

一種B細胞擴增用重組蛋白CD40L及其使用方法與流程引言B細胞免疫調(diào)節(jié)劑在治療免疫性疾病和癌癥方面有廣泛的應用前景。其中可針對單一抗原的免疫療法因其治療效果特異性高而備受關(guān)注。選擇適當高效的B細胞刺激因子，可以實現(xiàn)選擇性擴增難以識別抗原特異性B細胞，從而增強免疫應答和治療效果。例如，使用Cd40配體（CD40L）擴增已知的抗原特異性細胞對破骨細胞瘤或胃腸道腫瘤的免疫治療效果顯著提高。然而，野生型CD40L的使用有時會導致嚴重的副作用，包括T細胞介導的強烈免疫反應。為了克服這些問題，從人源化、CD40L的重組和優(yōu)化的研究中，開發(fā)了用于選擇性B細胞擴增的新型CD40L重組蛋白，可以更好地控制治療劑量、減少副作用。本文將對一種B細胞擴增用重組蛋白CD40L及其使用方法與流程進行詳細介紹。重組蛋白CD40L的構(gòu)建人類CD40L蛋白全長域（aa2-261）從人源化基因中取出，克隆到溫度敏感的大腸桿菌表達質(zhì)粒pLV-TH并進行表達。CD40L蛋白的多聚體組裝形式通過不同的表達條件進行了調(diào)節(jié)，在合適的熱敏感誘導條件下表達后得到的部分可溶峰較高，表明形成了大量高分子量且高度聚合的CD40L多聚體。最終通過柱層析技術(shù)純化出CD40L蛋白。CD40L蛋白經(jīng)大規(guī)模表達純化后，進行毒性、微生物學和質(zhì)量分析，結(jié)果表明該蛋白的生物活性高、質(zhì)量穩(wěn)定，符合國際規(guī)范的制藥級別、臨床試驗級別的標準。重組蛋白CD40L的結(jié)構(gòu)特征CD40L是一種TNF家族成員，N端存在一個一個外泌蛋白域(ECTO)，可以參與糖基化作用，同時在跨鏈錨接外泌后的CD40L中共有334個氨基酸殘基表現(xiàn)出了生物功能?？梢酝ㄟ^這些區(qū)域與CD40發(fā)生交互。具體來說，這個蛋白的主要結(jié)構(gòu)特征為單個蛋白分子是由兩個獨立單體的非常穩(wěn)定的三聚體組成的。重組蛋白CD40L的結(jié)構(gòu)基本上是圍繞數(shù)肽（尤其是T51）和冊激活結(jié)構(gòu)（尤其是區(qū)域3，K191-R202）的相互作用維持的。在沒有CD40的情況下，CD40L/K191-R202的區(qū)域可能存在（無法通過X射線晶體技術(shù)確定）。當CD40L和CD40（aa22-144）結(jié)合時，這些相互作用得到增強，CD40L-K196通過水橋接M近似與CD40-Y118的末端HC表面距離形成堿性極點極靠近的酸性東西，并且沒有一水橋，水橋的熱動力學性質(zhì)可能對CD40L/CD40結(jié)合的增強起到重要作用。這個結(jié)構(gòu)的揭示說明了重組蛋白CD40L與靶分子CD40的特異性相互作用，指導了重組蛋白CD40L的優(yōu)化設計。重組蛋白CD40L使用的方法目前，主要應用于CD40L的治療策略包括直接注射或基因工程B細胞等，從而實現(xiàn)對B細胞的選擇性激活而非對整個免疫系統(tǒng)的刺激。用于CD40L治療的最佳途徑取決于特定疾病的治療響應和對CD40L重組蛋白的生物學響應，以及需要治療的特定細胞類型的可使用方法。重組蛋白CD40L的穩(wěn)定性目前有一些研究表明，重組蛋白CD40L在99℃下可以穩(wěn)定30min以上，且在冰凍和化學不和條件下也表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性。相對于在37℃時失活較快的野生型CD40L，這個重組蛋白的穩(wěn)定性大大提高了其臨床應用的可能性。重組蛋白CD40L與細胞懸液的處理在擴增B細胞的過程中，操作人員應當先制備CD40L重組蛋白供使用。對于細胞處理，細胞從培養(yǎng)瓶內(nèi)取出并離心，將異物和紅細胞清除，并用緩沖液重懸細胞。這個緩沖液可以是簡單MM，PBS或RPMI，但是MM是最好的選擇。然后為每個實驗制定一個不同的應用（固相或液相）。對于液相，將每個“通孔”裝滿細胞懸液。對于固相，將96孔板中的各通道涂上所需抗原。測常量建議使用固相法。不同類型細胞的擴增一般在液相法擴增過程中，會根據(jù)目標樣本不同的來源選擇合適的CD40L作為刺激劑。對于人類B細胞，較常用的是哺乳動物的重組CD40L；對于小鼠B細胞，目前多采用融合的鼠類有癌細胞作為發(fā)酵宿主的可溶性CD40L。對于B細胞樣品的擴增，需要在細胞外液中加入CD40L。對于單純的核酸展示庫等項目，CD40L一般在液相條件下作為循環(huán)加入，在一小時之內(nèi)完成擴增。對于B細胞分選項目，需要將CD40L添加到混合物中，可以使用滴定法進行處理，稀釋CD40L后依次加入到混合物中。與一般已知的B細胞活化方法（如LPS或PHA）相比，CD40L在去髓皮化上更加特異，但是仍然需要保證相應的核酸展示庫配合CD40L進行擴增。結(jié)論重組蛋白CD40L是一種非常穩(wěn)定且結(jié)構(gòu)優(yōu)化的蛋白，具有廣泛的臨床應用前景。在使用CD40L擴增特定類型B細胞的過程中，需要根據(jù)不同類型的樣本選擇合適的CD40L