紅花風(fēng)沙藤莖葉的化學(xué)成分及其保肝作用

紅花風(fēng)沙藤莖葉的化學(xué)成分及其保肝作用

肖綠洲。是清遠屬植物，主要分布在卡斯特地形區(qū)。1設(shè)備和材料1.1實驗菌株鑒定小花清風(fēng)藤莖和葉采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興義市冊亨縣，經(jīng)三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室王玉兵教授鑒定為小花清風(fēng)藤S.parvifloraWall.exRoxb.，其標(biāo)本（201700227）現(xiàn)存于該實驗室。LO2細胞購于北納生物科技有限公司。1.2儀器、試藥和儀器DionexUltimate3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；LC-6AD半制備液相色譜儀（日本島津公司）；色譜柱（YMC-PackODA-A,250mm×10mm,10μm，半制備型；250mm×4.6mm,5μm，分析型，日本YMC公司）；BrukerAV400核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；ThermoScientificISQLT單四極桿質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；低溫冷凍干燥機（美國Labconco公司）；AL204-IC電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；3111型CO正相硅膠（100～200、200～300目，青島海洋所化工廠）；分析純石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇等（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（美國TEDIA公司）；1640培養(yǎng)基[賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶（武漢科瑞生物技術(shù)有限公司）；二甲基噻唑二苯基四嘩溴鹽（MTT,Sigma公司）。2方法2.1小清乳中z65z33的合成取干燥粉碎后的小花清風(fēng)藤莖葉5.4kg，用工業(yè)甲醇加熱回流（55℃）提取4次（15h/次）。減壓濃縮為浸膏。加水懸浮，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取。得到各部位浸膏，分別為石油醚部位浸膏70g、氯仿部位浸膏33g、醋酸乙酯部位浸膏28g、正丁醇部位浸膏24g。取27g石油醚部位浸膏，正相硅膠以石油醚-醋酸乙酯（100∶0→0∶1），醋酸乙酯-甲醇（100∶0→0∶1）進行梯度洗脫，將餾份合并為23個組分（Fr.1～23）。Fr.3析出晶體，經(jīng)過多次重結(jié)晶，得到化合物13(3.2mg);Fr.5通過SephadexLH-20以石油醚-氯仿-甲醇（1∶1∶1）洗脫，得到化合物14(1.4mg）、15(2.5mg）。取26g氯仿部位浸膏，通過正相硅膠柱以氯仿-甲醇（100∶0→0∶100）梯度洗脫，將餾份合并為14個組分（Fr.24～38）。將Fr.32與Fr.33合并后，通過正相硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到Fr.32.1～32.12；將Fr.32.2通過半制備高效液相色譜[乙腈-水（10∶90→100∶0）]得到化合物1(2.0mg）、2(2.7mg）、3(2.1mg);Fr.32.3通過半制備高效液相色譜[乙腈-水（10∶90→100∶0）]得到化合物4(6.2mg）；將Fr.27通過半制備高效液相色譜[乙腈-水（10∶90→100∶0）]分為Fr.27.1～27.6;Fr.27.5通過半制備高效液相色譜[乙腈-水（10∶90→100∶0）]得到Fr.27.5.1～27.5.6；將Fr.27.5.1通過薄層板制備[二氯甲烷-甲醇（11∶1）]，得到化合物5(3.2mg）；將Fr.27.5.3通過薄層板制備[二氯甲烷-甲醇（8∶1）]得到化合物6(1.2mg）；將Fr.27.4通過半制備高效液相色譜（乙腈-水30∶70）分為Fr.27.4.1～27.4.6；將Fr.27.4.2通過薄層板制備后，用SephadexLH-20以二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，再通過半制備高效液相色譜[甲醇-水（53∶47）]得到化合物7(3.4mg）、8(5.7mg）；將Fr.27.1用SephadexLH-20以二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物9(2.2mg）；將Fr.27.1.12通過半制備高效液相色譜[乙腈-水（10∶90→100∶0）]得到化合物10(1.8mg）、11(7.5mg）、12(2.1mg）。取粉碎后的小花清風(fēng)藤莖葉13kg，用工業(yè)甲醇加熱回流（55℃）提取2次（4h/次）。減壓濃縮為浸膏。加水懸浮，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取。得到各部位浸膏，分別為石油醚部位浸膏145.8g、醋酸乙酯部位浸膏140.1g、正丁醇部位浸膏76.7g。取60g正丁醇浸膏，通過大孔樹脂以乙醇-水（0∶100→100∶0）梯度洗脫，得到81個餾份（z1～z81），通過高效液相色譜分析，將z56～z71合并為Fr.39；將Fr.39通過反相硅膠柱色譜，以甲醇-水（10∶90→100∶0）梯度洗脫，得到Fr.39.1～39.24；將Fr.39.13通過半制備高效液相色譜[甲醇-水（45∶55）]得到化合物16(14.7mg）；將Fr.39.17通過半制備高效液相色譜[甲醇-水（57∶43）]得到化合物17(34.0mg）；將Fr.39.15通過半制備高效液相色譜[甲醇-水（42∶58）]得到化合物18(1.8mg）；將Fr.39.18通過半制備高效液相色譜（甲醇-水48∶52）得到化合物19(25.1mg）；將Fr.39.20通過ToyopearlHW-40F，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物20(1.3mg）；將Fr.39.17.1通過半制備高效液相色譜[乙腈-水（38∶62）]得到Fr.39.17.1.1～39.17.1.3；將Fr.39.17.1.1通過半制備高效液相色譜[甲醇-水（58∶42）]得到化合物21(12.5mg）、22(23.8mg）。2.2對于龍眼2細胞的評估藥物保護2.2.1精細培養(yǎng)和藥物處理參考文獻方法2.2.2lo2細胞存活率測定采用MTT比色法，測定前4h，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），終止培養(yǎng)，吸出上清液，再加入DMSO150μL/孔，待結(jié)晶溶解后，測定每孔492nm的吸光度（A）值，計算LO2細胞的存活率。細胞存活率=(A2.2.3多組間差異分析所有實驗數(shù)據(jù)通過SPSS13.0軟件分析，以單因素方差分析（one-wayANOVA）進行多組間差異的比較，以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1化合物結(jié)構(gòu)鑒定化合物1：白色粉末。EI-MSm/z:313[M]化合物2：白色粉末。EI-MSm/z:254[M]化合物3：白色粉末。EI-MSm/z:236[M]化合物4：白色粉末。EI-MSm/z:299[M]化合物5：白色粉末。EI-MSm/z:325[M]化合物6：白色粉末。EI-MSm/z:323[M]化合物7：白色粉末。EI-MSm/z:267[M]化合物8：白色粉末。EI-MSm/z:281[M]化合物9：無色結(jié)晶[二氯甲烷-甲醇（1∶1）]。EI-MSm/z:168[M]化合物10：白色粉末。EI-MSm/z:254[M]化合物11：無色油狀物。EI-MSm/z:155[M]化合物12：白色粉末。EI-MSm/z:128[M]化合物13：無色針狀結(jié)晶[氯仿-甲醇（1∶1）]。EI-MSm/z:470[M]化合物14：無色針狀結(jié)晶[氯仿-甲醇（1∶1）]。EI-MSm/z:456[M]化合物15：白色針狀晶體[氯仿-甲醇（1∶1）]。EI-MSm/z:454[M]化合物16：白色粉末。EI-MSm/z:534[M]化合物17：白色粉末。EI-MSm/z:372[M]化合物18：淡黃色粉末。EI-MSm/z:358[M]化合物19：淡黃色無定形粉末。EI-MSm/z:714[M]化合物20：黃色針狀結(jié)晶[二氯甲烷-甲醇（1∶1）]。EI-MSm/z:286[M]化合物21：黃色無定形粉末。EI-MSm/z:536[M]化合物22：黃色無定形粉末。EI-MSm/z:536[M]3.2保肝護肝活性檢測活性測試結(jié)果（圖1）顯示，化合物8、11、13、14、16、20和22給藥組細胞存活率與模型組相比，有明顯的增高，表明化合物8、11、13、14、16、20和22有顯著的保肝護肝活性。4活性測試結(jié)果小花清風(fēng)藤是布依族、苗族民間用藥，用其根莖入藥，可用于醫(yī)治急性黃疸型肝炎。在臨床上該藥材也可用于