蕎麥蜜改善酒精誘導(dǎo)的小鼠肝臟及腸道菌群的研究

蕎麥蜜改善酒精誘導(dǎo)的小鼠肝臟及腸道菌群的研究

飲酒和健康是全世界人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。長(zhǎng)期或過(guò)度飲酒對(duì)身體有害。肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所，長(zhǎng)期或過(guò)量飲酒容易引起酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD),其發(fā)展進(jìn)程依次為：酒精性脂肪肝(脂肪變性)、脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，具有多種生物活性1材料和方法1.1試劑與儀器蕎麥蜜，產(chǎn)地為阿爾泰，由武漢樂(lè)神三寶蜂業(yè)有限公司提供；Lieber-Decarli酒精液體鼠糧和Lieber-Decarli對(duì)照液體鼠糧購(gòu)買于戴茨生物科技(無(wú)錫)有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所；總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(TG)試劑盒，浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；肝臟病理學(xué)切片，武漢市皮諾飛生物科技有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純。SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(18±2)g,許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。1.2儀器、檢測(cè)方法HI96785蜂蜜色度測(cè)定儀，哈納水環(huán)境工程(上海)有限公司；配有示差折光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，島津20AD,日本島津公司；Agilent7800ICP-MS,美國(guó)Agilent公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)ThermoFisher公司；F6/10手持式高速勻漿機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；低溫高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Ependoff公司；倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司。1.3卜方特比色計(jì)比色法色度的測(cè)定采用SN/T0852-2012《中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)規(guī)程》中專用的卜方特比色計(jì)比色法。用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，將不含氣泡的試樣倒入卜方特(Pfund)比色槽內(nèi)，以卜方特比色計(jì)進(jìn)行比色讀取色值后確定色澤，色值單位為mm?？偡雍康臏y(cè)定參照Folin-Ciocalteu比色法糖含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)礦物質(zhì)元素的測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.268-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》。1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案動(dòng)物模型參照Bertola等1.5小鼠體質(zhì)量變化肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所，過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致熱量增加、攝食減少、代謝異常等情況，使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，加劇對(duì)肝臟的損傷，體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的變化在一定程度上可以反映肝臟的損傷程度。建立模型期間，每天記錄小鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠體質(zhì)量的變化量。解剖取出肝臟后，用預(yù)先冷卻的生理鹽水洗去血液，用濾紙吸干并稱質(zhì)量。肝臟指數(shù)按照公式(1)計(jì)算：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%(1)1.6生化指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)ALT升高反映了肝細(xì)胞膜的損傷，AST升高表明肝細(xì)胞損傷到了細(xì)胞器，AST和ALT是反映肝損害和樣品是否有保護(hù)肝損傷效果的最直接和最重要的指標(biāo)。酒精性肝損傷的初期表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，而TC和TG是評(píng)估脂肪肝發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和病情分度的重要指標(biāo)，其中TG的關(guān)聯(lián)度更高?；钚匝踝杂苫l(fā)的氧化應(yīng)激是多種肝損傷發(fā)生的共同病理生理基礎(chǔ)，MDA、SOD指標(biāo)可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激程度。血清AST、ALT活力、肝臟TC、TG含量、血清MDA含量、肝臟SOD活力等指標(biāo)的測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.7切片病理學(xué)觀察肝臟組織固定后，經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水和石蠟包埋后用病理切片機(jī)進(jìn)行切片，將切片再次經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水、脫蠟后用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片病理學(xué)形態(tài)。1.8微生物多樣性分析：大鼠糞便腸道菌群與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。評(píng)估腸道菌群穩(wěn)態(tài)通常分析其物種多樣性和豐富度的變化、物種組成差異等。其中，1.9數(shù)據(jù)的顯著性分析本研究數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),采用Duncan’s多重比較法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1蕎麥蜜、葡萄糖的理化性質(zhì)和含量蜂蜜的抗氧化活性與其組成成分相關(guān)，尤其是酚類化合物、礦物質(zhì)等，因此對(duì)蕎麥蜜中的主要相關(guān)成分進(jìn)行了測(cè)定。蕎麥蜜的色度值為150mm,為深色蜜。果糖和葡萄糖的含量為43.03和35.19g/100g,二者總和超過(guò)60g/100g,蔗糖未檢測(cè)出，符合GB14963-2011對(duì)蜂蜜糖含量的規(guī)定。重要的是蕎麥蜜的總酚含量高達(dá)(145.81±3.93)mg/100g,明顯高于其他品種的蜂蜜2.2小麥蜜對(duì)肝臟疾病的影響是已知的小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的變化結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1A所示，與空白對(duì)照組相比，酒精的攝入使小鼠體質(zhì)量顯著減輕(2.3麥冬蜜對(duì)肝臟疾病的影響是ast小鼠血清中ALT和AST活力測(cè)定結(jié)果如圖2所示。酒精模型組的ALT和AST活性明顯高于空白對(duì)照組(2.4小麥蜜對(duì)酒精引起的肝臟損傷大鼠肝臟tg和tg的影響對(duì)肝臟中的TC和TG含量進(jìn)行測(cè)定。由圖3可知，持續(xù)的酒精飼喂導(dǎo)致小鼠肝臟中TC和TG水平顯著升高(2.5小麥蜜對(duì)酒精引起的肝臟損傷大鼠mda和sod的影響MDA、SOD反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激程度，結(jié)果如圖4所示。與空白對(duì)照組相比，酒精模型組的MDA值顯著升高(2.6肝組織病理學(xué)檢測(cè)各處理組肝臟病理學(xué)切片結(jié)果見(jiàn)圖5,直觀反映了各組小鼠肝臟損傷的情況?？瞻讓?duì)照組(C)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，胞漿內(nèi)無(wú)脂滴分布，無(wú)氣球樣變性和炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象，肝組織無(wú)異常改變。在酒精模型組(M)很明顯可以看出，胞漿內(nèi)有大量脂滴分布，結(jié)構(gòu)紊亂，表明酒精模型組肝臟脂肪變性嚴(yán)重。在使用蕎麥蜜干預(yù)(B)后，可以觀察到胞漿內(nèi)脂滴明顯減少，肝細(xì)胞較完整且肝細(xì)胞排列趨于正常，肝臟脂肪變性明顯減輕，這表明蕎麥蜜對(duì)酒精引起的肝臟脂肪變性有明顯的改善作用，肝臟受到很好的保護(hù)。2.7大鼠腸道菌群的組成如圖6所示，各組的測(cè)序深度均接近于1,且無(wú)顯著性差異(2.8不同因素可導(dǎo)致關(guān)系失調(diào)如圖7所示，3組樣本聚為3類，空白對(duì)照組與酒精模型組完全分開(kāi)，而同樣給予酒精的樣品干預(yù)組也與空白對(duì)照組分開(kāi)，與酒精模型組也幾乎分開(kāi)，說(shuō)明了空白對(duì)照組與酒精模型組和樣品干預(yù)組的腸道菌群組成存在差異，而且酒精模型組與樣品干預(yù)組的腸道菌群組成也存在差異。因此，酒精和蕎麥蜜的攝入使小鼠腸道菌群的組成發(fā)生了改變。腸道菌群的各菌種間形成一種互相制約、互相依存的平衡關(guān)系，多種因素可導(dǎo)致其失調(diào)。通過(guò)對(duì)小鼠糞便腸道菌群進(jìn)行不同水平上的物種組成分析，比較不同組之間的物種組成差異，門水平結(jié)果如圖8和9所示。由圖8可知，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在門水平上主導(dǎo)腸道菌群的組成，占比90%左右，其次還包括Proteobacteria、Epsilonbacteraeota、Deferribacteres、Actinobacteria、Fusobacteria、Tenericutes、Spirochaetes等。由圖9A～D可知：與空白對(duì)照組相比，酒精的攝入使厚壁菌門相對(duì)豐度增加了24.56%,擬桿菌門相對(duì)豐度下降了4.4%,Proteobacteria相對(duì)豐度下降了21.6%,厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)的比例升高了30.30%;而蕎麥蜜的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，與酒精模型組相比，蕎麥蜜干預(yù)組厚壁菌門降低15.59%,擬桿菌門升高7.18%,二者的比值下降21.25%,并基本恢復(fù)到與空白對(duì)照組一致的水平。為進(jìn)一步說(shuō)明蕎麥蜜的攝入是否對(duì)酒精引起的腸道菌群變化有改善作用，對(duì)屬水平相對(duì)豐度排前36的菌屬進(jìn)行了差異分析(圖10)。由圖10可知，各組間微生物相對(duì)豐度存在差異。圖11A～C中，各組中3討論3.1小麥蜜對(duì)大鼠、肝臟指數(shù)和組織病理學(xué)的影響脂肪變性、體質(zhì)量減輕是酒精性肝損傷發(fā)生的癥狀，在酒精肝損傷早期往往伴隨著肝臟的腫大，從而使肝臟指數(shù)升高3.2大麥蜜對(duì)肝臟疾病的影響如肝臟疾病