結核病的實驗室診斷方法及評價

結核病的試驗室診斷方法及評價耐多藥結核病的試驗室診斷條件：因耐多藥結核分枝桿菌的生物危急性，需P2及以上試驗室，目前我院試驗室條件根本具備馬上投入運行，日常培育及涂片用的生物安全柜濾膜已超出訪用年限，工作人員生物安全得不到保障，應定期予以更換。耐多藥結核分枝桿菌主要以結核分枝桿菌體外藥物敏感性測定作為其診斷依據(jù)。因此其根底是培育，只有培育出陽性結核分枝桿菌才能進一步通過結核分枝桿菌體外藥物敏感性測定診斷是否為耐多藥結核分枝桿菌。已進人臨床常規(guī)應用的測定方法:目前包括確定濃度法、比例法BACTEC460、BACTEC960、BacT/ALERT3D、ESPII系統(tǒng)快速檢測結核分枝桿菌的藥物敏感性。其中:確定濃度法以最低抑菌濃度或以無生長為終點作為推斷標準，是我國目前普遍承受的方法;比例法以是否能夠抑制99%的細菌生長作為推斷標準，是世界衛(wèi)生組織推舉使用的方法;后四種儀器方法則是比例法的特化，其特點是以細菌的代謝過程指示細菌生長狀況。處于爭論探究階段的測定方法:此類方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌體生物擴增法、液體變色培育基測定法、熒光素酶測定法、硝酸鹽復原試驗等。3分子生物學方法對結核分枝桿菌耐藥性檢測已有一些進入臨床檢測?；蛲蛔兪且鹂菇Y核藥物耐藥性的最主要的緣由。多種以PCR為根底的分子生物學技術用于檢測與耐藥相關基因的突變，作為快速耐藥性檢測方法在試驗室或臨床得到開展。這些方法具體包括：主要是DNA序列分析法，聚合鏈反響-單鏈構象多態(tài)性分析〔PCR-SSCP〕，另外還包括基因芯片技術、異質性雙鏈構象分析、變性梯度凝膠電泳、線性探針雜交技術、RNA/RNA錯配檢測技術和分子燈塔技術等。由于結核分枝桿菌的耐藥性與基因突變的精準關系未完全說明，檢測耐藥相關基因的分子生物學方法雖然能快速準確地檢測到耐藥相關基因的突變，但由于推斷藥物敏感性時存在固有的缺陷，檢測結核分枝桿菌耐藥性的基因型鑒定法不能完全替代表型鑒定法。結核病的試驗室診斷方法及評價(一)標本的采集痰標本采集發(fā)病人應在抗結核藥物治療前留取痰標本。治療中的病人應停藥2～3天后留取痰標本。病人于早晨漱口后，留取3～5ml合格的痰標本(深咳后吐出的黏液痰、膿樣痰、干酪樣痰、褐色血樣痰或含少量穎血液的血痰)，遇到唾液或口永，應重留取。至少采集3次。WHO推舉的采集容器為國際通用的螺旋蓋痰瓶、可密封塑料盒或蠟紙盒。痰容器上應標明病人姓名、編號、檢查工程和容器序號。胃沖洗液幼兒不會吐痰，常將痰液咽下，故可用早晨空腹胃洗出液，直接涂片染色或進展結核桿菌培育，連續(xù)作三次可提高培育陽性率。胃液結核桿菌檢出率以浸潤性肺結核和干酪性肺炎為最高，其次為粟粒型肺結核。胃液、痰液或其他分泌物中結核桿菌檢查，有時對診斷有打算性意義。支氣管肺泡灌洗和支氣管沖洗支氣管肺泡灌洗和支氣管沖洗液5ml病灶組織或干酷塊等先用組織研磨器磨碎后再行涂片。尿液留全量夜尿，靜置4或5小時后，棄上清液，取沉淀局部10ml，3000rpm30min，取沉渣涂片。體液或腦脊液無菌操作收集體液或腦脊液，放置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后涂片。也可將腦脊液離心沉淀，3000rpm，離心30min，棄上清液，取沉淀物涂片。(二)試驗方法及評價1．細菌學診斷方法涂片檢查法：包括直接涂片法、熒光染色涂片法和集菌涂片琺。痰液、膿液可直接涂片。用萋爾-尼爾遜染色法(Ziehi-Neelsen)簡稱萋尼染色法，假設鏡檢找到抗酸性桿菌，則可能是結核桿菌。此法簡便、快速，技術要求低，無需特別儀器且能當天出結果，格外經(jīng)濟，符合我國國情。但其敏感性差，一般需5000～10000條菌／ml才能得到陽性結果；特異性差，各種分枝桿菌均可著色，要進一步鑒定是否為結核分枝桿菌；不能區(qū)分死菌與活菌?！据履崾先旧ā竣偻科喝〗?jīng)95％乙醇擦拭脫脂過的枯燥、清潔、無油污、無劃痕的玻璃片(玻片不能重復使用)，于玻片反面的左端1／3處以藍色或黑色記號筆(玻璃鉛筆)編號。用接種環(huán)挑取痰標本的膿樣，干酪樣局部約0.05～0.1ml，于玻片正面的右側23處，均勻涂沫成10mm×20mm②試劑：⊙堿性復紅乙醇染色儲存液：堿性復紅液：895％乙醇100ml中。5％石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100ml蒸餾水中。③染色步驟；【熒光染色法】①試劑：染色劑z金胺“O”0．1g溶于95％乙醇10ml，加5％石炭酸90ml。脫色劑：3％鹽酸乙醇液。復染劑：0.5％高錳酸鉀水溶液。②染色步驟：③鏡檢與報告方式：在暗色背景下，抗酸桿菌呈黃綠色或橙色熒光。必需用40×物鏡確認菌體形態(tài)，應具有萋-納氏抗酸染色鏡經(jīng)檢驗后，方可應用熒光染色法，留意勿過讀或漏判。熒光染色后涂片應在24h4℃保存，次日完成鏡檢。物鏡20×檢查結果按以下標準報告：陰性(-)：050可疑(+)；1～3條／50視野陽性(1+)：l1～99條／50視野(2+)：1～9(3+)：10～99(4+)：≥100物鏡40×檢查細菌細胞形態(tài)。常規(guī)培育法：結核分枝桿菌培育陽性是確診結核病的“金標準”。改進羅氏培育法是目前較為成熟的分別培育方法，依據(jù)結核桿菌生長緩慢，菌落枯燥、顆粒狀、乳酪色像菜花狀，菌體染色抗酸性強等特點推斷是否為結核桿菌。如菌落、菌體染色都不典型,則可能為非典型分枝桿菌，應進一步作鑒別試驗。此法培育時間長，不適于快速檢測結核桿菌，且陽性率也只有30％～40％，使大量結核病人漏診或誤診。同時各種分枝桿菌均可生長，也需進一步鑒定是否為結核分枝桿菌?！雅嘤Y果報告方式：抗酸桿菌培育陰性：斜面無菌落生長。抗酸桿菌培育陽性(1+)：菌落生長占斜面面積的1／4?？顾釛U菌培育陽性(2+)：菌落生長占斜面面積的1／2?？顾釛U菌培育陽性(3+)：菌落生長占斜面面積的3／4。抗酸桿菌培育陽性(4+)：菌落生長布滿全斜面。抗酸桿菌培育陰性應以“(培育陰性)”報告。菌落生長缺乏以斜面面積1／4時，實報菌落數(shù)?？焖倥嘤ǎ孩貰actecMGIT960分枝桿菌快速培育、藥敏檢測系統(tǒng)的根本原理是，其所使用的培育瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當分枝桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活而發(fā)出熒光。檢測系統(tǒng)每隔60分鐘連續(xù)測定培育管內(nèi)熒光強度，來推斷管內(nèi)分枝桿菌生長狀況。②BacTALERT3D培育系統(tǒng)：是另一類分枝桿菌快速培育、藥敏檢測系統(tǒng)，也可用于一般細菌的培育。其原理是所使用的培育瓶底部，有顏色感應器，當分枝桿菌在瓶中生長，有CO2產(chǎn)生時，顏色感應器由綠色變?yōu)辄S色。系統(tǒng)自動連續(xù)檢測數(shù)據(jù)輸入計算機，依據(jù)計算結果自動顯示有無分枝桿菌生長。此法無放射性，顯著縮短培育時間，且操作簡便、自動化強，還可進展快速菌型鑒定。但液體培育基中不能觀看菌落形態(tài)，儀器與試劑價格較貴。液體變色培育基(MBRedox系統(tǒng))：該系統(tǒng)由改進米氏7H9培育基、促生長添加劑(血清、復合維生素等)、抗生素混合物PACT(多黏菌素B、兩性霉素B、茶啶酸、甲氧芐胺嘧啶)和氧化復原顯示器(即無色四鎓鹽)組成。促生長添加劑可加速分枝桿菌的生長和甲臜(formazan)的形成。其原理是當分枝桿菌在此培育基生長時，通過氧化復原系統(tǒng)，使培育基中的無色四唑鎓鹽復原成粉紅色、紅色或紫色甲臜。由于甲臜不溶于水．以顆粒形式分泌到細胞外表，分枝桿菌菌落就變成了用肉眼可見的紅或紫色，取培育液涂片，染色鏡檢。此法操作簡便，培育時間短，肉眼觀看結果，無需特別儀器，無放射性污染，還可用于分枝桿菌的藥敏試驗和菌種鑒定。但陽性率還不夠高，結果觀看存在主觀性。噬菌體裂解試驗：由于恥垢分枝桿菌噬菌體是一種DNA病毒，能特異感染相應的活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)快速增殖?裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，又可感染隨后參與的指示細胞(也是一種分枝桿菌)，并使指示細胞裂解，在培育平板上消滅噬菌斑。依據(jù)噬菌斑的有無，即可確定待檢標本中是否含有相應的活的分枝桿菌。此方法簡便、快速，不需特別儀器；特異性和靈敏度較高；檢測的是活菌，但傳染性?。豢上鄬Χ靠蓽y定藥物敏感性。其主要步驟為：①標本前處理：同常規(guī)培育法(假設用菌株則勿需此步)，經(jīng)前處理后的標本于Middlebrook7H9培育基中(含有改進的OADC養(yǎng)分添加劑)37℃溫育24h。②噬菌體浸染：取0.5ml上述處理后的樣品(或菌液)，參與0．1ml分枝桿菌噬菌體，震蕩混勻，37℃孵育1b。③中止浸染：于上述浸染液中加人0.1ml殺毒劑，徹底混勻，室溫作用5min，參與5mlMiddlebrook7H9培育液和1ml指示細胞。④澆注平皿和培育：將上述混合培育液與5ml溶化的瓊脂共同傾注于無菌平皿中，旋轉混勻，靜置成形后，于37℃培育18～24h。每次檢測同時設空白比照、嘴菌體比照、殺毒劑比照、指示細胞比照和陰性及陽性比照。⑤結果觀看：在各比照組結果正確的條件下，觀看試驗樣品結果。陽性結果可見有大小和數(shù)量不等的噬菌斑消滅(彩圖2)，或很多嘴菌斑相互融合成透亮狀；陰性結果可見指示細胞在瓊脂培育基中均勻生長．無噬菌斑消滅。常用的免疫學診斷方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymeLinkedimmunosorbentas-say，ELISA)：ELISA爭論和應用報道最多的試驗方法。①ELISA間接法：其根本原理是吸附在固相載體上的結核抗原可與待檢標本中的結核抗體結合，形成抗原-抗體復合物，后者與酶標記的抗人IgG結合，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，酶使底物顯色。顏色的深淺與待檢標本中的結核抗體含量成正比。本法主要用于測定結核抗體。②雙抗體夾心ELISA：其原理是吸附在固相載體上的結核抗體可與待檢標本中的結核抗原結合，形成抗體-抗原復合物，后者與酶標記的結核抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，酶使底物顯色，顏色的深淺與待檢標本中的結核抗原含量成正比。本怯主要用于特異性結核抗原的測定。③抗原競爭ELISA：其原理是吸附在固相載體上的結核抗體，可與標本中的待檢結核抗原及同時參與的酶標的結核抗原發(fā)生競爭結合，形成抗體抗原和抗體-酶標抗原兩種復合物，后者可使酶作用的底物顯色，顏色的深淺與待檢標本中結核抗原的含量成反比。本法主要用于小分子抗原的測定。生物素-親和素-酶免疫測定法(biotin-avidin-system，BAS-酶免法)：根本原理類似于ELISA，只是用BAS來標記酶，而不是用抗體或抗原標記酶。BAS有三種根本測定方法，分別稱ABC法(avindin-biotin-complex)。BA法(biotin-avidin)和BAB法(bridged-avdin-biotintechnique)。前二種方法主要用于結核抗體或抗原的測定，BAB斑點酶免疫滲透試驗 (dotimmunoenzymefiltrationassav，DIEFA)：是在酶免疫結合試驗根底上進展起來的一種固相標記免疫測定技術。其原理是利用微孔膜的可濾過性，使反響溶液自膜上快速通過，從而完成抗原、抗體的快速測定。本法包被所需的抗原量少，預先包被、封閉、枯燥后可長期保存?zhèn)溆?。敏感性和特異性與ELISA法相當。但操作更簡潔，反響更快速，價格較廉價，結果只需肉服觀看，無需特別儀器，重復性好。斑點免疫金結合試驗(dotimmunogoldfiltrationassayDIGFA)：根本步驟為：本法用膠體金標記抗人IgG，由于膠體金本身呈紅色，不需再加顯色底物，陽性反響即為紅色斑點。比ELlSA法削減了參與底物和終止液的步驟，操做更為簡便快速；本法在可濾過性膜上進展抗原、抗體反響，反響時間僅為3～5min；金標試劑比酶標試劑穩(wěn)定，室溫保存時間較長。②斑點免疫層析試驗(dotimmunochromatographicassavDICA)：DICA的反響物與DIGFA根本一樣，反響物固定在一狹長的微孔膜上，制成單一試劑形式，反響利用膜的毛細管作用進展。微孔膜A端含有枯燥的金標抗人IgG，中段點有特異性結核抗原，末段點有人IgG。僅需少量待檢血清(或其他體液標本)滴在A端，并加人數(shù)滴稀釋液，使膜中的金標抗人IgG溶解，假設待檢標本中含有結核抗體特異性IgG即與金標抗人I90結合形成復合物，并隨液體向前方移動，至膜的中段時即與結核抗原結合，形成抗原抗體金標抗體復合物，消滅紅色條帶為陽性結果。如待檢樣品中不含結核抗體，則在測試區(qū)不消滅條帶。液體連續(xù)往前移動，并在末段的試劑質控區(qū)與正常人IgG結合，形成Igo金標抗人IgG復合物，消滅紅色條帶，證明試劑反響系統(tǒng)正常。DICA測定方法簡便、快速，在結核抗體檢測中受到廣泛關注。免疫印跡技術(immunoblotting或Westernblot)；是高分別SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-)與高敏感性酶聯(lián)反響相結合的一種檢測技術。包括SDS-、蛋白質轉印和固相酶免疫測定三步。SDS-泳至固相膜上，并保持其原有的物質類型和生物學活性不變，然后利用抗原-抗體特異性反響進展檢測。通過該技術可以了解抗原抗體反響的數(shù)目、被識別的抗原電泳遷移率以及抗原抗體反響的強度，從而有助于抗體聯(lián)合檢測和抗原鑒定的爭論。目前，此技術已轉化為產(chǎn)品，只進展后半步酶聯(lián)免疫反響，即可檢出待檢標本中所含的多種結核桿菌多膚抗原成分的特異性抗體。此法敏感性和特異性很高，是很有進展前景的測定技術，已廣泛用于科研，在臨床診斷活動性結核病人也有很高的價值。分子生物學診斷核酸探針(nuclearacidprobe)：分枝桿菌的核酸探針有四種主要類型：cDNA或rRNADNA探針、克隆的DNA或PCR擴增片段探針及寡核甘酸探針等。此法特異性強，可以鑒定不同種群的分枝桿菌，有助于肺結核的診斷和鑒別診斷，但其敏感性低，價格昂貴，不適用于日常臨床診斷工作。聚合酶鏈反響(poLymerasechainreationPCR)：主要依據(jù)DNA復制原理，其過程類似于體內(nèi)細胞分裂時DNA半保存復制過程。其擴增的每一循環(huán)，包括模板變性、引物退火及延長三個步驟。PCR技術關鍵是設計一對特異性DNA引物，該引物所引導的DNA擴增序列，應是結核桿菌獨有的，且是結核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測結果的特異性。PCR的靈敏度高，可達1個結核桿菌。能早期診斷結核菌血癥，在結核桿菌感染的早期，特別是在結核病灶通過血源性外傳播時，外周血中存在極少量的結核桿菌時，通過PCR就可以檢測到結核桿菌。檢測時間短，僅需2～4h。目前存在的最大問題是假陽性率和假陰性率較高，造成假陽性的最主要緣由是試驗室污染。DNA序列測定：不僅能夠用于突變的檢測，而且能夠確定突變的部位與性質，因此是檢測基因突變的最抱負方法，也是推斷突變的“金標準”和評價其他方法的參考方法。 DNA序列測定有多種方法．但PCR-DNA序列測定簡便、快速，是最常用的測定方法，已在結核分枝桿菌耐藥基因爭論中，得到廣泛應用。隨著DNA測序技術的自動化、規(guī)?；?、商品化，以及本錢的降低，為今后分枝桿菌基因序列的信息爭論以及分枝桿菌菌種鑒定供給了便利條件?；蛐酒夹g：又稱DNA芯片技術，是近年進展起來的進展大規(guī)模遺傳多態(tài)性檢測的方法，是目前分子生物學最前沿的方法。原理是將多種探針分子固定于支持物上，與標記樣品分子進展雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，獵取樣品分子的數(shù)量和序列信息。測定耐藥性的主要步驟為：①制備測定耐藥性的基因芯片；②獲待測樣品DNA并進展PCR擴增和標記：③擴增產(chǎn)物與點樣制備的芯片進展雜交、顯色；④掃描檢測、數(shù)據(jù)處理、結果判定。該法基于核酸雜交的技術，同時將大量探針固定于支持物上，所以一次可以對樣品大量序列進展檢測和分析，它有技術操作簡潔、自動化程度高、序列數(shù)量大、檢測效率高、應用范圍廣等特點。但基因芯片的制備比較簡潔，本錢較高，儀器設備也較貴，不適用于臨床標本的檢測。目前，基因芯片技術已在結核分枝桿菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性測定及基因組比較分析爭論中得以應用，其中尤以耐藥性測定最為引人關注。細胞因子檢測主要包括酶聯(lián)免疫吸附法〔 ELISA〕和固相酶聯(lián)免疫斑點技術〔ELISPOT〕兩種。結核分枝桿菌感染人體后，刺激免疫細胞產(chǎn)生保護性細胞因子，其中最主要的是IFN-γ。通過檢測IFN-γ濃度可對結核分枝桿菌埋伏感染及結核病的診斷供給參考。目前主要應用于結核性漿膜炎的診斷。細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDFELISPOT通過顯色反響，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清楚可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT計算機分析系統(tǒng)對斑點進展計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。流式細胞術用于結核分枝桿菌藥物敏感性試驗的原理和步驟FCM用于結核分枝桿菌藥物敏感性試驗所承受的細胞染色法是乙酰乙酸熒光素〔FDA〕染色法。FDA是一種非極性非熒光物質，它能通過主動轉運和被動集中的方式穿透分枝桿菌的細胞壁和細胞膜?；畹姆种U菌胞質中非特異性酯酶能夠快速水解外來的FDA成為游離熒光素，游離熒光素在菌體內(nèi)蓄積易被流式細胞儀測定；而死菌的活性酯酶削減，不能或僅能水解少量的 FDA，產(chǎn)生很少的游離熒光素。FCM通過測量熒光信號的轉變，判定活菌或死菌，從而用于結核分枝桿菌藥物敏感性試驗。將確定量的結核分枝桿菌菌懸液參與到確定濃度抗結核藥物的液體培育基，37℃培育24h〔或48h〕；同樣數(shù)量的結核分枝桿菌菌懸液參與到不含抗結核藥物的液體培育基中，37℃培育24h〔或48h〕作為質控；取上述菌懸液參與到混有FDA的PH7.4的PBS中，37℃靜置30minFCMFCM隨機軟件對每min細胞數(shù)〔標記的結核分枝桿菌數(shù)〕和平均熒光強度〔標記的結核分枝桿菌熒光強度〕兩項參數(shù)進展分析，從而對結果進展統(tǒng)計分析。蛋白芯片在結核分枝桿菌爭論中的應用現(xiàn)有的結核蛋白芯片是以微孔濾膜為載體，將結核分枝桿菌的特異性抗原如阿拉伯甘露糖〔LAM〕，38Kda蛋白和16Kda蛋白等固定在其外表，利用微孔濾膜的滲透、濃縮、分散作用，捕獲被檢樣品中的特異性抗體，使抗原抗體反響在固相膜上快速進展，再以免疫金作為標記物而直接在膜上顯色形成紫紅色的斑點。顯色后通過芯片識別系統(tǒng)進展分析，判定結果用于該類細菌感染的臨床關心診斷。其特點是可對多種結核分枝桿菌抗原之抗體進展同時篩查，便利、快速而又有較高的特異性與敏感性，對于痰涂陰性、無痰的、肺外結核病人的