DNA的提取及鑒定課件

DNA的提取及鑒定DNA的提取及鑒定一、動物肝臟中DNA的提取一.實驗目的學習和掌握用濃鹽法從動物組織中提取DNA的原理和技術了解分離提取DNA的一般原理一、動物肝臟中DNA的提取一.實驗目的DNA的主要來源1.動物組織及器官：脾、肝、胸腺、魚類精子等。2.植物：種子的胚芽等3.微生物：細菌、酵母菌等核酸和蛋白質在生物體中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于細胞核中，RNA主要存在于核仁及細胞質中。DNA的主要來源核酸提取的主要步驟：1.破碎細胞：研磨、組織勻漿、超聲波、凍融；一硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）2.除去與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂類等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白質變性（SDS、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌3.除去其他不需要的核酸分子4.沉淀核酸，去除鹽類，有機溶劑等雜質核酸提取的主要步驟：生物體組織細胞中的脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分與蛋白質結合，以核蛋白——脫氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，這兩種復合物在不同的電解質溶液中的溶解度有較大差異。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨NaCl濃度的增加而逐漸降低，當NaCl濃度達到0.14mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的1%（幾乎不溶）；但當NaCl濃度繼續(xù)升高時，DNP的溶解度又逐漸增大，當NaCl濃度增至0.5mol/L時，DNP的溶解度約等于純水中的溶解度，當NaCl濃度繼續(xù)增至1.0mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP則不一樣，它在濃NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同濃度的NaCl溶液將DNP和RNP分別抽提出來。

二.實驗原理生物體組織細胞中的脫氧核糖核酸（DNA的提取及鑒定ppt課件將抽提得到的DNP用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，DNA即與蛋白質分開，可用氯仿-異丙醇將蛋白質沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入適量的乙醇，DNA即析出，進一步脫水干燥，即得白色纖維狀的DNA粗制品。為了防止DNA(或RNA)酶解，提取時加入乙二胺四乙酸

(EDTA)。大部分多糖在用乙醇或異丙醇分級沉淀時即可除去。

DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色反應。將抽提得到的DNP用十二烷基硫酸鈉（動植物的DNA核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液，但在0.14mol/l的鹽溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白則溶于0.14mol/l鹽溶液，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占優(yōu)勢，

DNA或RNA都能溶于水中，而不溶于有機溶劑。用絡合劑EDTA抑制核酸水解酶的活力,同時用去污劑SDS把蛋白質和DNA分開,再用氯仿-異丙醇作為蛋白質的變性劑沉淀蛋白質,最后用乙醇把DNA沉淀出來。動植物的DNA核蛋白能溶于水及高濃三、提取DNA的注意事項1.避免過酸、過堿及高溫2.加入DNA酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、EDTA、SDS、苯酚等3.蛋白變性劑反映不宜過于劇烈，以防機械張力使核酸鏈破壞。4.加入RNA降解酶除RNA5.操作迅速三、提取DNA的注意事項1.避免過酸、過堿及高溫四、實驗器材1.搗碎機

2.離心機

3.手術剪

4.離心管

5.刻度吸管

6.燒杯（100ml，250ml）

7.玻棒

8.新鮮動物肝臟

9.石英比色皿

10.量筒（10ml，100ml）11.容量瓶（50ml）四、實驗器材1.搗碎機五、實驗試劑1、0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉溶液（pH6.8）。2、0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L檸檬酸三鈉溶液：氯化鈉0.828克及檸檬酸三鈉0.341克溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。3、95%乙醇（A.R.）。4、NaCl固體（A.R.）。5、5%SDS溶液：5gSDS溶于100ml水中。6、氯仿（A.R.）。7、V（氯仿）：V（異戊醇）混合液20：1五、實驗試劑1、0.1mol/LNaCl-0.05mol/六、實驗操作1）粗提1．稱取豬肝8g于100ml的小燒杯中，用剪刀剪碎，加入2倍重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液（16ml），高速勻漿。2．將勻漿液（~25ml）轉移到100ml離心管中，在4000r/min下離心10min，棄去上清液。沉淀中繼續(xù)加入25ml緩沖液，攪拌均勻后于4000r/min離心20min，取沉淀。2）分離DNP、除蛋白3．將上述沉淀轉移至250ml燒杯中，加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液、21ml氯仿/異戊醇、4ml5%SDS，用保鮮膜封口，振搖30min。4．緩慢加入3.6gNaCl（事先在研缽中研成粉末）使體系終濃度為1mol/L。將混合液轉移至離心管中于3500r/min離心20min，取上清水相（用滴管吸取并量體積）。六、實驗操作1）粗提3）沉淀DNA5．在水相中加入等體積95%乙醇，邊加邊用玻璃棒朝一個方向慢慢攪動直至溶液澄清，將DNA凝膠纏繞在玻璃棒上，用濾紙吸去多余的乙醇，得DNA粗品?！咀ⅰ坑貌０衾p繞DNA有困難時，亦可緩慢搖動燒杯以助于DNA聚集。

6．將DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作為待測樣品。3）沉淀DNADNA鑒定或定量（二苯胺法）：

顏色反應可先完成標準曲線的制作，或配置一個標準管。DNA鑒定或定量（二苯胺法）：DNA的提取及鑒定ppt課件CECS694-02IntroductiontoBioinformaticsUniversityofLouisvilleSpring2004Dr.EricRouchka(二)二苯胺法測定DNA含量二、原理

核酸含量的測定方法包括紫外吸收法、定磷法和分別針對DNA和RNA的顏色反應方法本實驗采用針對DNA的二苯胺法測DNA的含量。在酸性溶液中，DNA與二苯胺共熱生成藍色化合物，該物質在595nm有最大吸收，在40～400mg/mL范圍內其峰值與DNA含量成正比

100℃冰醋酸，少量硫酸藍色物DNA+CECS694-02IntroductiontoDNA鑒定或定量（二苯胺法）：

空白管標準管測定管標準DNA溶液01.0待測樣品溶液1.0蒸餾水2.01.01.0二苯胺試劑4.04.04.060°C水浴30-40min，冷卻，595nm比色。計算：C測=C標*A測/A標w=C測*50ml/8g(DNAμg/g樣品)

DNA鑒定或定量（二苯胺法