一種CAR-γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)裝置與流程

一種CAR-γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)裝置與流程背景CAR-T細(xì)胞療法作為癌癥治療的新型技術(shù)已經(jīng)獲得了重大突破，但在臨床使用中還存在一些缺點(diǎn)，如難以處理的嚴(yán)重副作用和面臨T細(xì)胞消耗、CAR-T細(xì)胞耐藥等的問題。針對(duì)這些問題，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開始開發(fā)和研究CAR-T細(xì)胞治療的新型方法。本文介紹一種不同于傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞的新型CAR-γδT細(xì)胞，并描述其培養(yǎng)方法及培養(yǎng)裝置流程。簡介CAR-γδT細(xì)胞是一種由特殊γδT細(xì)胞經(jīng)過改造產(chǎn)生的人工免疫細(xì)胞，具有普通γδT細(xì)胞的天然殺傷效應(yīng)以及CAR-T細(xì)胞的特殊作用，能夠有效地識(shí)別并殺傷癌細(xì)胞，同時(shí)避免傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞引起的不必要損傷。實(shí)驗(yàn)方法制備培養(yǎng)基這種培養(yǎng)基為α-MEMmedium+10%FBS的混合物，添加80μg/mLPen/Strep及1%Nacetylcysteine(NAC)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染將采集的人類和小鼠的γδT細(xì)胞，采用經(jīng)典的Nucleofection技術(shù)轉(zhuǎn)染ThermoFisherScientific公司生產(chǎn)的CAR-γδ鏈質(zhì)粒。質(zhì)粒中包含多肽信號(hào)序列，抗體識(shí)別域、CD3z（TCR激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）及4-1BB（T細(xì)胞增殖及防止細(xì)胞凋亡）等基本元素。然后將細(xì)胞培養(yǎng)于有NAC處理的培養(yǎng)基中，初始細(xì)胞密度為1-2x105個(gè)/ml。細(xì)胞擴(kuò)增為了提高細(xì)胞擴(kuò)增的效率，可以使用CD3抗體作為活化劑。將細(xì)胞分種在CD3抗體（5μg/mL）預(yù)處理的96孔板上，每孔加入2x105個(gè)CAR-F+γδT混合細(xì)胞和相應(yīng)的培養(yǎng)基，經(jīng)過72小時(shí)培養(yǎng)，通過切口進(jìn)一步生長細(xì)胞，細(xì)胞飽和程度達(dá)到70%-80%時(shí)收割。細(xì)胞激活將收獲的細(xì)胞在有NAC處理的培養(yǎng)基中進(jìn)行24小時(shí)的激活，并加入CD3抗體（5μg/mL），IL-2和IL-15（均為30ng/mL）。細(xì)胞凈化在細(xì)胞生長至80%時(shí)，將細(xì)胞計(jì)數(shù)后將培養(yǎng)基與細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移到50ml管中，加入比重為1.077的離心液進(jìn)行離心（400×g，30min）。此后將所得的細(xì)胞層取出，加上純化培養(yǎng)基，經(jīng)離心洗滌（400×g，10min）后再加上適量的純化培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。得到后均可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞染色和形態(tài)學(xué)觀察。培養(yǎng)裝置與流程在實(shí)驗(yàn)中需要使用的培養(yǎng)裝置主要有生化平臺(tái)、培養(yǎng)箱和顯微鏡.生化平臺(tái)：對(duì)于研究CAR-γδT細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)需要對(duì)所用培養(yǎng)基進(jìn)行組合調(diào)整，選購功能強(qiáng)大的生化平臺(tái)可以大大提高生產(chǎn)效率，為實(shí)驗(yàn)成功打下良好的基礎(chǔ).培養(yǎng)箱：對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)需要統(tǒng)一環(huán)境和條件。培養(yǎng)箱可以提供穩(wěn)定環(huán)境和基本條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功是至關(guān)重要的.顯微鏡：可以實(shí)現(xiàn)對(duì)CAR-γδT細(xì)胞的即時(shí)監(jiān)控，在觀測(cè)形態(tài)學(xué)的變化方面更具有優(yōu)勢(shì)。在進(jìn)行CAR-γδT細(xì)胞的培養(yǎng)中主要有以下步驟：采集γδT細(xì)胞和轉(zhuǎn)染：從人體外周血或小鼠脾中采集相應(yīng)細(xì)胞，培養(yǎng)基添加CAR-γδ鏈質(zhì)粒，經(jīng)過轉(zhuǎn)染后即可進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)環(huán)節(jié)。細(xì)胞擴(kuò)增：將轉(zhuǎn)染后CAR-γδ鏈質(zhì)粒的γδT細(xì)胞和CD3抗體混合在一起有彼此共同增殖之后，再將細(xì)胞培養(yǎng)在特定的流程中，確保細(xì)胞良好的生長。細(xì)胞激活：經(jīng)過細(xì)胞分解后加入相應(yīng)的復(fù)合物內(nèi)活性物質(zhì)，激活T細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的生長。細(xì)胞凈化:進(jìn)行固態(tài)離心，將污染物去除，并再次轉(zhuǎn)入特定的培養(yǎng)器中，進(jìn)行下一次篩選。結(jié)論CAR-γδT細(xì)胞的產(chǎn)生對(duì)于未來的治療產(chǎn)生了新的思路。借助本文介紹的新型CAR-γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法及裝置，