galecin-7在eca-1049細胞中的表達及意義

galecin-7在eca-1049細胞中的表達及意義

癌癥是人類常見的腫瘤之一。在中國大陸地區(qū),食管癌的主要類型為鱗狀細胞癌,發(fā)病率居全國惡性腫瘤第五位,死亡率居第四位Galectin-7屬于半乳凝素族的一員,具有高度的組織特異性,其表達大多局限于復層上皮細胞中大量的文獻已經證實了半乳凝素在細胞凋亡中的作用。基于Galectin-7與其同族蛋白質具有共同功能的理論,大量的研究都集中在Galectin-7對于細胞凋亡的作用。Galectin-7在DLD-1細胞中的異位表達,使DLD-1細胞對許多不同的凋亡刺激更敏感,而過表達Galectin-7的轉染組DLD-1細胞比空載體組細胞增殖顯著降低考慮到Galectin-7與細胞凋亡的聯(lián)系以及抗增殖的作用,它應該對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到抑制的作用。然而通過幾種實驗模型系統(tǒng)的觀察發(fā)現,在腫瘤中Galectin-7表達增加,并且可能與腫瘤進展有關研究人員普遍認為,半乳凝素存在于細胞外及細胞內區(qū)室中。雖然它們不是分泌蛋白,但半乳凝素可通過非經典分泌途徑或是富含半乳凝素的囊泡分泌到細胞外。因此,它們常在正?；颊吆湍[瘤患者的血清中被發(fā)現。例如,正常人的血清里就能檢測到Galectin-3的存在,而在患有惡性疾病的患者血清中能檢測到顯著高于正常水平的Galectin-3本研究擬使用食管鱗癌細胞株Eca-109為研究對象,檢測其細胞上清液中Galectin-7的表達,并通過重組Galectin-7培養(yǎng)細胞觀察其在細胞外的具體作用及其可能的機制。1材料和方法1.1試劑與儀器Eca-109由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所提供。胎牛血清(FBS)購于四季青公司;改良型1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司;重組人半乳凝集素-7購于優(yōu)爾生公司;β-乳糖(β-lactose)購于上海廣銳生物科技有限公司;青霉素和鏈霉素購于碧云天生物公司;總RNA提取試劑盒購于Omega公司;逆轉錄試劑盒、SYBRGREENI購于TaKaRa公司;兔抗人Galectin-7(Galectin-7)、基質金屬酶-9(MMP-9)、p38、pp38抗體購于Proteintech公司;兔抗人β-actin抗體購于鼎國生物公司;HRP標記二抗(IgG)購于Proteintech公司;超濾離心管(molecularweightcutoffof3kDa)購于Millipore公司;一抗/二抗洗脫液購于碧云天公司;MTT購于Amresco公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.2重組galectin-7的培養(yǎng)Eca-109細胞株常規(guī)采用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),在各組細胞的培養(yǎng)基中加入不同劑量的重組Galectin-7,培養(yǎng)條件為37°C、飽和濕度及5%CO對照組:NC組(無處理組);濃度實驗組時間實驗組:對照組和濃度實驗組培養(yǎng)細胞24h,時間實驗組分別培養(yǎng)8,16,24h。1.3galectin-7是在細胞外清液中檢測的1.3.1離心社會化處理收集細胞培養(yǎng)上清液10mL,10000r/min離心5min×3,以去除細胞碎片。將上清液加入內管,14520r/min離心(4°C預冷)30min,即得濃縮10倍的細胞上清液。離心結束,將內管倒置在另一離心管中,5000r/min離心5min后,收集濃縮液約1000μL。取800μL按上述方式以14520r/min離心5min,濃縮成400mL20倍濃縮上清液。多次超濾離心后可得到40倍、80倍的濃縮上清液。1.3.2對照組細胞蛋白質提取收集對照組細胞1×101.4實時、定量pcr檢測pmp-9mnmra的發(fā)現1.4.1總rna提取及紫外分光光度計算按照OMEGAE.Z.N.ATotalRNAKit說明書,將各實驗組及對照組細胞分別提取總RNA,紫外分光光度計定量并計算D1.4.2逆轉錄并進行分析采用TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒PrimeScriptRTReagentKit進行逆轉錄:依次加入2μL5×PrimeScriptBuffer、0.5μLOligodTPrimer、0.5μLRandom6mers、0.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixI,最后加入RNaseFreedH1.4.3熒光定量pcr檢測參照TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqII說明書,以GAPDH為內參。MMP-9上游引物序列為:5′-TCGAACTTTGACAGCGACAAG-3′;下游引物序列為:5′-ACTGAGGAATGATCTAAGCCC-3′;擴增片段長度為:263bp。GAPDH上游引物序列為:5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′;下游引物序列為:5′-TCTAGAGGGCAGGTCAGGTCCACC-3′,擴增片段長度為231bp。使用美國Bio-Rad公司iCycleriQ熒光定量PCR分析儀進行PCR反應,擴增條件為:95°C預變性2min;95°C10s,55°C15s,72°C15s,完成40個循環(huán)。擴增結束后,PCR儀自動繪制熔解曲線,鑒定產物的特異性。通過21.5許氏詞合板顯示了mmp-9、pp38和p38的性能1.5.1提取的蛋白質收集各實驗組細胞1×101.5.2galectin-7多克隆抗體的制備各組細胞蛋白液經過BCA法蛋白定量后,取25μL加入5×上樣緩沖液,于95°C水浴5min后上樣。然后行8%的SDS凝膠電泳,再進行蛋白轉膜,電轉完畢后將PVDF膜用5g/L脫脂奶粉常溫封閉2h,加入兔抗人Galectin-7多克隆抗體及兔抗人β-actin多克隆抗體于4°C孵育過夜。NC組及g1.6細胞成像試驗檢查細胞移植能力將對數期Eca-109細胞接種到六孔板中,每孔細胞數為5×101.7mtt法測定細胞克隆取對數生長期Eca-109細胞,用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化。10%RPMI1640培養(yǎng)基調整細胞密度為2×101.8數據分析和統(tǒng)計學處理使用SPSS17.0軟件進行數據分析和處理,比較各組間的差異有無顯著性,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。2結果2.1al明法中galectin-7的表達Westernblot檢測超濾離心濃縮細胞上清液與對照組細胞中Galectin-7的表達,結果顯示(圖1),在濃縮80倍的上清中檢測到了Galectin-7的表達,明顯低于對照組細胞內的表達(由于是檢測細胞上清液和細胞內的蛋白表達,故沒有內參的條帶)。2.2在不同的galectin-7濃度和時間培養(yǎng)條件下，mmp-9在mrna和蛋白質水平上的發(fā)現差異為分析Galectin-7在Eca-109中誘導MMP-9表達與培養(yǎng)時間的關系,我們通過實時熒光定量PCR檢測g2.3添加galectin-7來培養(yǎng)細胞，并改變p38路徑蛋白質Westernblot檢測NC組細胞和g2.4galectin-7對eca-119細胞遷移能力的影響為觀察Galectin-7對Eca-109細胞遷移能力的影響,我們進行了細胞劃痕實驗,實驗結果顯示,不同Galectin-7濃度下Eca-109細胞遷移能力均有增強,增強幅度與濃度正相關(圖3)。2.5在不同濃度下融合galectin-7培養(yǎng)下腫瘤細胞生長將NC、g3galectin-7對垃圾污染的細胞外轉移作用在本研究中,為了了解Galectin-7是否存在于細胞外,我們使用超濾離心技術對Eca-109細胞培養(yǎng)上清液進行了濃縮,通過免疫印跡實驗,在80倍濃縮的上清液中發(fā)現了Galectin-7的存在,從而證明了我們的猜想。這一結果也表明Galectin-7與其他半乳凝素族蛋白一樣都可以被細胞分泌到細胞外,從而拓展了研究的途徑和方向。Galectin-7在細胞中的作用,不再局限于細胞內,其細胞外的作用更值得關注?；啄な亲钃跄[瘤細胞轉移的重要組織屏障之一,IV型膠原是構成基底膜的主要成分。在腫瘤細胞轉移的過程中,細胞外基質的降解為腫瘤細胞的移動打開通道,腫瘤細胞可以釋放各種蛋白水解酶降解在侵襲和轉移中遇到的不同組織屏障。MMP-9是基質金屬蛋白酶的一種,是IV型膠原的主要水解酶,因此,MMP-9可以通過水解IV型膠原,從而達到降解ECM及基底膜的目的,使腫瘤細胞沿著基底膜缺損和基質空隙侵入周圍組織及血管。在本研究中,我們觀察到將重組人Galectin-7加入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞后,MMP-9無論在基因水平還是蛋白水平都出現了顯著的相應的上升,表明細胞外的Galectin-7參與了MMP-9的表達調控。在加入β-lactose后對MMP-9的作用出現了抑制,提示Galectin-7誘導MMP-9的作用位點可能與細胞膜上的特異性糖基受體有關。而與對照組相比,實驗組細胞中pp38表達水平上升明顯,提示Galectin-7可能激活了p38MAPK通路,從而提高了MMP-9的表達,這一發(fā)現與Park等為進一步研究Galectin-7在食管癌細胞侵襲轉移過程中的作用,我們進行了細胞劃痕實驗。實驗結果表明,Galectin-7使得實驗組Eca-109細胞的體外遷移能力較對照組細胞出現了明顯的上升,并且與Galectin-7的濃度正相關,從而進一步證實了Galectin-7在食管癌細胞侵襲和轉移過程中的重要作用。而在MTT實驗中我們發(fā)現,加入不同濃度的重組Galectin-7培養(yǎng)細胞后,與對照組對比,在5d內各實驗組細胞的增殖情況幾乎一致,說明Galectin-7在細胞外對于細胞增殖沒有明顯的作用。我們的研究結果表明,Galectin-7在食管鱗癌細胞中通過非經典途徑分泌到細胞外,通過結合細胞膜上的特異性糖基受體激活了p38MAPK通路,從而提高了MMP-9的表達,增強了細胞的侵襲遷移能力。而對于食管鱗癌增殖能力并沒有明顯影響,這可能與蛋白存在的位置及細胞的惡性程度有關,在正常上皮細胞的表達中,Galectin-7定位于細胞內部,發(fā)揮著促進細胞分化,維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用。當上皮細胞出現癌變后,由于基因的改變,Galectin-7受體在細胞內表達降低,進而使其維持細胞穩(wěn)態(tài)的功能缺失。Galectin-7被細胞分泌到胞外通過結合特異性糖基受體促進MMP-9的表達。近年來,癌癥相關的蛋白糖基化的改變已經引起了很多關注。因此,對糖蛋白上的糖類具有高度特異性的結合蛋白(凝集素)已經作為癌癥和大量疾病的標志物,也可以作為治療靶點,這對于半乳糖凝集素家族的成員尤其如此1.3.3pvdf蛋白凝膠的制備將40