氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)-氨基酸基本知識

單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目一氨基酸基本知識的學(xué)習(xí)

任務(wù)二氨基酸的主要理化性質(zhì)氨基酸純品均為白色結(jié)晶，熔點較高（200～300℃），各種氨基酸均能溶于水，但溶解度不同。所有氨基酸都不溶于乙醚、氯仿等非極性溶劑，而均溶于強酸、強堿中。1、一般物理性質(zhì)由于空間的排列位置不同，氨基酸有兩種構(gòu)型：D型和L型，組成蛋白質(zhì)的氨基酸，都屬L型。20種氨基酸，除甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子均為不對稱碳原子。可以有立體異構(gòu)、有旋光性。氨基酸的構(gòu)型也是與甘油醛構(gòu)型比較而確定的。從蛋白質(zhì)酶促水解得到的α-氨基酸，都屬于L-型，但在生物體中(如細菌)也含有D-型氨基酸。氨基酸的旋光性和光吸收3.氨基酸是兩性電解質(zhì)同一分子上帶有能釋放質(zhì)子的正離子基團和能接受質(zhì)子的負離子基團。兼性離子本身既是酸又是堿。因此它既可以和酸反應(yīng)，也可以和堿反應(yīng)。氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時，都以兼性離子形式存在。等電點理論的應(yīng)用A.等電點時，氨基酸的溶解度最小，易沉淀。利用該性質(zhì)可分離制備某些氨基酸。例如谷氨酸的生產(chǎn)，即將微生物發(fā)酵液的pH值調(diào)至3.22（谷氨酸的等電點）而使谷氨酸沉淀析出。B.利用各種氨基酸的等電點不同，可通過電泳法、離子交換法等在實驗室或工業(yè)生產(chǎn)上進行混合氨基酸的分離或制備。氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兼性離子。在兼性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。PH1710凈電荷+10-1正離子兼性離子負離子氨基酸的pK值和氨基酸解離的關(guān)系

4.氨基酸的特殊反應(yīng)單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目一氨基酸基本知識的學(xué)習(xí)

任務(wù)三氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用1.氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病的關(guān)系氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，它參與體內(nèi)代謝和各種生理機能活動。健康人靠膳食中的氨基酸或蛋白質(zhì)獲取機體對營養(yǎng)的需求。2.治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物此類氨基酸及其衍生物有谷氨酸及其鹽酸鹽、谷氨酰胺、乙酰谷酰胺鋁、甘氨酸及其鋁鹽、硫酸甘氨酸鐵、組氨酸鹽酸鹽等3.治療肝病的氨基酸及其衍生物治療肝病的氨基酸有精氨酸鹽酸鹽、磷葡精氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸、谷氨酸鈉、蛋氨酸、乙酰蛋氨酸、賴氨酸鹽酸鹽及天冬氨酸等精氨酸還是肝性昏迷禁鈉病人的急救用藥。蛋氨酸和乙酰蛋氨酸用于慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝、藥物性肝障礙的治療。4.用于治療腫瘤的氨基酸及其衍生物不同癌細胞的增殖需要大量消大量某種特定氨基酸,尋找這些氨基酸的類似物—代謝拮抗劑可能成為癌癥治療的一種有效手段。(1)以氨基酸作為載體的抗腫瘤藥物，如苯丙氨酸芥子氣，L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸與苯二胺氮芥共結(jié)合物。(2)利用氨基酸衍生物作為腫瘤細胞所需氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物達到抗腫瘤的目的，如S-氨甲酰-L-半胱氨酸。(3)氨基酸衍生物作為酶抑制劑的抗腫瘤藥物。如N-磷酸乙酰-L-天門冬氨酸是一個天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酚基酶的過渡狀況抑制劑，利用這個抑制劑可中斷嘧啶核苷酸的合成途徑達到抗腫瘤目的。(4)氨基酸衍生物作為中間產(chǎn)物的腫瘤抑制劑。(5)使癌細胞逆轉(zhuǎn)的氨基酸衍生物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)偶氮絲氨酸、E-羥基甘氨酸、N-甲基酪氨酸、N-氮乙基胺基-L-苯丙氨酸等抗腫瘤活性大于自力霉素。單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目一氨基酸基本知識的學(xué)習(xí)

任務(wù)四氨基酸的生產(chǎn)方法（一）蛋白水解法（二）化學(xué)合成法（三）酶法（四）直接發(fā)酵法（五）前體發(fā)酵法（六）氨基酸輸液及其配制方法（一）蛋白水解法以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白為原料，通過酸、堿或酶水解成多種氨基酸的混合物，經(jīng)分離純化獲得各種氨基酸的生產(chǎn)方法。目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法。水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過程為水解、分離、精制結(jié)晶三個步驟。目前，我國至少有6種氨基酸尚需要用提取法生產(chǎn)，如組氨酸、精氨酸、亮氨酸、絲氨酸、胱氨酸及酪氨酸。（二）化學(xué)合成法最大優(yōu)點是在氨基酸的品種上不受限制，除制備天然氨基酸外，還可用于制備各種特殊結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸。合成得到的氨基酸都是DL型外消旋體，必須經(jīng)過拆分才能得到人體能夠利用的L-氨基酸。故用化學(xué)合成法生產(chǎn)氨基酸時，除需要考慮合成工藝條件外，還要考慮消旋異構(gòu)體的拆分與D-異構(gòu)體的分離，三者缺一都必會影響其應(yīng)用?，F(xiàn)在用合成法制造的氨基酸有DL-丙氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、絲氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。兼用合成法的有蘇氨酸和纈氨酸。（三）酶法酶法是應(yīng)用完整的菌體或自微生物細胞提取的酶類制備氨基酸的方法天冬氨酸已于1973年用固定化菌體進行工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，這是世界上最早在發(fā)酵工業(yè)上用固定化菌體的例子。目前，能用酶法生產(chǎn)的氨基酸已有10多種，如：用延胡索酸和銨鹽為原料，經(jīng)天冬氨酸酶催化生產(chǎn)L-天冬氨酸；用L-天冬氨酸為原料，在天冬氨酸-β-脫羧酶作用下生產(chǎn)L-丙氨酸。氨基酸基質(zhì)微生物產(chǎn)率/（g/L）丙氨酸天冬氨酸Ps.dacunbe200天冬氨酸延胡索酸Enoiniaaerbicda168酪氨酸甲酚+丙酮酸Enoiniaaerbicda62多巴（二羥基苯丙氨酸）兒茶酚+丙酮酸Enoiniaaerbicda55色氨酸吲哚+丙酮酸雷氏變形桿菌915-羥基-色氨酸5-羥基吲哚+丙酮酸雷氏變形桿菌28賴氨酸2-氨基己內(nèi)酰胺羅倫隱球酵母140酶法生產(chǎn)氨基酸

以糖類和銨鹽為主要原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。這些方法成立的一個重要原因是使用選育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。（四）直接發(fā)酵法野生菌株發(fā)酵營養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)酵氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株發(fā)酵營養(yǎng)缺陷型兼抗性突變株發(fā)酵。直接發(fā)酵法1、用野生株的方法

分離的野生菌株具備積累產(chǎn)物的特性，可用于直接發(fā)酵（產(chǎn)率低）。如谷氨酸發(fā)酵。

通過轉(zhuǎn)換發(fā)酵，可延伸獲得其它產(chǎn)物。主要采用改變培養(yǎng)條件。如谷氨酸發(fā)酵中改變銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵。2、用營養(yǎng)缺陷變異株的方法

這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵等。谷氨酸棒狀桿菌的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛高絲氨酸高絲氨酸磷酸O-琥珀酸高絲氨酸二氫吡啶-2,6-二羧酸賴氨酸蘇氨酸異亮氨酸蛋氨酸天冬氨酸12345黃色短桿菌的代謝過程

人工控制黃色短桿菌的代謝過程生產(chǎn)賴氨酸高絲氨酸脫氫酶可以大量積累天冬氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ天冬氨酸激酶中間產(chǎn)物Ⅱ甲硫氨酸蘇氨酸高絲氨酸賴氨酸人工誘變的菌種不能產(chǎn)生應(yīng)用營養(yǎng)缺陷性突變株生成氨基酸氨基酸微生物營養(yǎng)缺陷型氨基酸微生物營養(yǎng)缺陷型賴氨酸谷氨酸棒桿菌高絲氨酸纈氨酸谷氨酸棒桿菌亮氨酸蘇氨酸大腸桿菌蛋氨酸、纈氨酸鳥氨酸谷氨酸棒桿菌瓜氨酸或精氨酸苯丙氨酸谷氨酸棒桿菌酪氨酸瓜氨酸谷氨酸棒桿菌精氨酸酪氨酸谷氨酸棒桿菌丙氨酸、嘌呤高絲氨酸谷氨酸棒桿菌蘇氨酸亮氨酸谷氨酸棒桿菌苯丙氨酸脯氨酸谷氨酸棒桿菌異亮氨酸3、類似物抗性變異株的方法用一種與自己想獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)相類似的化合物加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其發(fā)生控制作用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機制的，能夠生成過量的氨基酸。利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸?？菇Y(jié)構(gòu)類似物突變

一種氨基酸終產(chǎn)物，在正常的情況下，參與蛋白質(zhì)合成，過量時可抑制或阻遏它自身的合成酶類。如果這種氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物也顯示這種抑制或阻遏，但卻不能用于蛋白質(zhì)的合成，那么當(dāng)用這種結(jié)構(gòu)類似物處理菌株時，大多數(shù)細胞將由于缺少該種氨基酸而不能生長或者死亡，而那些對該結(jié)構(gòu)類似物不敏感的突變株，仍然能夠合成該種氨基酸而繼續(xù)生長。

抗結(jié)構(gòu)類似物突變突變株之所以能抵抗這種結(jié)構(gòu)類似物，是因為被該氨基酸（或結(jié)構(gòu)類似物）反饋抑制的變構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使結(jié)構(gòu)類似物不能與結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化的阻遏蛋白或酶結(jié)合，突破了原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這些突變株就可產(chǎn)生大量的該種氨基酸。這種突變稱為抗結(jié)構(gòu)類似物突變。

高絲氨酸脫氫酶例如，在黃色短桿菌的賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸生物合成中，選育抗蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物2-氨基-3-羥基戊酸（AHVr）突變株，得到了具有反饋抑制抗性，高絲氨酸脫氫酶活性提高1300倍，能積累14g/L蘇氨酸的突變株。氨基酸微生物結(jié)構(gòu)類似物氨基酸微生物結(jié)構(gòu)類似物賴氨酸乳糖發(fā)酵短桿菌S--（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）異亮氨酸黃色短桿菌AHV，2-氨基-4-乙硫丁酸（Eth），2-TA，AEC蘇氨酸黃色短桿菌α-氨基-β-羥基戊酸（AHV）纈氨酸谷氨酸棒桿菌AEC苯丙氨酸黃色短桿菌對-氟苯丙氨酸（PFP）鳥氨酸谷氨酸棒桿菌D-精氨酸及精氨酸氧肟酸酪氨酸黃色短桿菌5-甲基色氨酸（5-MT）瓜氨酸黃色短桿菌磺胺胍色氨酸黃色短桿菌AHV精氨酸枯草桿菌精氨酸氧肟酸應(yīng)用結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株生成氨基酸氨基酸微生物營養(yǎng)缺陷型結(jié)構(gòu)類似物賴氨酸乳糖發(fā)酵短桿菌腺嘌呤、鳥嘌呤

蘇氨酸黃色短桿菌蛋氨酸

苯丙氨酸谷氨酸棒狀桿菌酪氨酸

酪氨酸谷氨酸棒狀桿菌丙氨酸

色氨酸谷氨酸棒狀桿菌苯丙氨酸、酪氨酸PAP，PFP，Yyrhx，

phehx（噻嗯基苯丙氨酸氧肟酸）異亮氨酸黃色短桿菌嘌呤AHV亮氨酸乳糖發(fā)酵短桿菌蛋氨酸、異亮氨酸2-噻唑亮氨酸鳥氨酸枯草桿菌精氨酸精氨酸氧肟酸瓜氨酸黃色短桿菌精氨酸硫代異惡唑精氨酸黃色短桿菌鳥嘌呤2-TA高絲氨酸谷氨酸棒狀桿菌蛋氨酸、賴氨酸AHV4.應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型和抗性突變株生成氨基酸（五）前體發(fā)酵法此法是以氨基酸的中間產(chǎn)物為原料，用微生物將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基酸，這樣可以避免氨基酸生物合成途徑中的反饋抑制作用。目前，這一方法主要用于因不能避開其反饋調(diào)節(jié)機制，而難以用直接發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸。已成功地用鄰氨基苯甲酸作為前體物工業(yè)化生產(chǎn)L-色氨酸，用甘氨酸作為前體工業(yè)化生產(chǎn)L-絲氨酸。氨基酸前體（中間產(chǎn)物）微生物產(chǎn)率絲氨酸甘氨酸嗜甘油棒狀桿菌16色氨酸氨茴酸異常漢遜酵母3色氨酸吲哚麥角菌13蛋氨酸2--羥基-4-甲基-硫代丁酸脫氨極毛桿菌11異亮氨酸α--氨基丁酸黏質(zhì)賽氏桿菌8

D--蘇氨酸阿氏棒狀桿菌15（六）氨基酸輸液及其配制方法常用的氨基酸輸液是由多種結(jié)晶L-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內(nèi)輸注液。這種輸液對病人的蛋白質(zhì)合成有良好促進作用，用于治療肝性昏迷、消化道吸收功能障礙引起的低蛋白血癥、大面積燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷及感染等疾患。氨基酸輸液的組成和要求有：（1）所有氨基酸均為L-型；（2）必須含8種必需氨基酸和兩種半必需氨基酸；（3）必需氨基酸與非必需氨基酸應(yīng)按一定比例組成；（4）有些輸液還需加入山梨醇、木糖醇、維生素、無機離子等以補充能量，提高營養(yǎng)價值和氨基酸利用率。氨基酸輸液的配制方法可按如下步驟：（1）取三分之二注射用水加溫至90℃，依次投入穩(wěn)定而難溶氨基酸、攪溶；（2）加入易溶氨基酸及穩(wěn)定劑（NaHSO3、半胱氨酸）；（3）降溫，用10％NaOH調(diào)pH4.5～5.5，補足注射用水；（4）加入0.1％～0.2％活性炭脫色30min，過濾；（5）超濾（截留值1～2萬），分裝，壓蓋，105℃蒸氣滅菌30min，冷卻后即為氨基酸輸液成品。單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項目一氨基酸基本知識的學(xué)習(xí)

任務(wù)一氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類一、氨基酸的組成與結(jié)構(gòu)

含有一個堿性氨基又含有一個酸性羧基的有機化合物。其氨基直接連接在α-碳原子上，這種氨基酸被稱為α-氨基酸。

肽和蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。氨基酸的結(jié)構(gòu)

甘氨酸Glycine

脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine纈氨酸Valine

脂肪族氨基酸氨基酸的結(jié)構(gòu)

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine纈氨酸Valine亮氨酸Leucine

脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine纈氨酸Valine亮氨酸Leucine異亮氨酸Ileucine脂肪族氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine纈氨酸Valine亮氨酸Leucine異亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline

亞氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine纈氨酸Valine亮氨酸Leucine異亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine含硫氨基酸

甘氨酸Glycine

丙氨酸Alanine纈氨酸Valine亮氨酸Leucine異亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine半胱氨酸Cysteine含硫氨基酸

苯丙氨酸Phenylalanine

芳香族氨基酸

苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine

芳香族氨基酸

苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸Trytophan芳香族氨基酸吲哚基團

精氨酸Arginine

堿性氨基酸

精氨酸Arginine賴氨酸Lysine

堿性氨基酸2，6-二氨基己酸

精氨酸Arginine賴氨酸Lysine組氨酸Histidine堿性氨基酸

天冬氨酸

Aspartate

酸性氨基酸

天冬氨酸Aspartate

谷氨酸Glutamate酸性氨基酸

絲氨酸Serine

含羥基氨基酸

絲氨酸Serine

蘇氨酸Threonine含羥基氨基酸

天冬酰胺Asnaragine含酰胺氨基酸

天冬酰胺Asnaragine谷氨酰胺Glutamine含酰胺氨基酸氨基酸的分類及特點1.根據(jù)極性非極性R基氨基酸：Ala、Val、Leu、ILe、Pro、Ph