氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)

單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目三賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)二賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)（一）種子制備賴氨酸發(fā)酵一般根據(jù)接種量及發(fā)酵罐規(guī)模采用二級(jí)或三級(jí)種子培養(yǎng)。斜面種子培養(yǎng)基組成：牛肉膏1%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，葡萄糖0.5%（保藏斜面不加），瓊脂2%，pH=7.0～7.2。經(jīng)0.1MPa、30min滅菌，在30℃保溫24h，檢查無(wú)雜菌，放冰箱備用。

一級(jí)種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖2.0%，(NH4)2SO40.4%，K2HPO40.1%，玉米漿1%～2%，豆餅水解液1%～2%，MgSO4·7H2O0.04%～0.05%，尿素0.1%，pH=7.0~7.2。0.lMPa、滅菌15min。接種量約為5%～10%。培養(yǎng)條件：在l000ml的三角瓶中，裝200ml一級(jí)種子培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻后接種，在30～32℃振蕩培養(yǎng)15～16h，轉(zhuǎn)速100～120r/min。二級(jí)種子培養(yǎng)基：除以淀粉水解糖代替葡萄糖外，其余成分與一級(jí)種子相同。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度30～32℃，通風(fēng)比1:0.2m3/（m3?min），攪拌轉(zhuǎn)速200r/min。培養(yǎng)時(shí)間8～11h。（二）發(fā)酵工藝控制賴氨酸發(fā)酵過(guò)程分為兩個(gè)階段，發(fā)酵前期（約0～12h）為菌體生長(zhǎng)期，主要是菌體生長(zhǎng)繁殖，很少產(chǎn)酸。當(dāng)菌體生長(zhǎng)一定時(shí)間后，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期。工藝的控制，應(yīng)該根據(jù)兩個(gè)階段的不同而異。2.發(fā)酵培養(yǎng)基組成不同菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成不完全相同。（1）碳源由于賴氨酸產(chǎn)生菌株生長(zhǎng)較緩慢，初糖濃度不宜過(guò)高，一般掌握在80～100g/L；為了提高單位發(fā)酵容積的產(chǎn)量，采用高濃度的葡萄糖液流加補(bǔ)充碳源，流加糖液濃度一般為500～600g/L。（2）氮源賴氨酸發(fā)酵消耗的氮源要比谷氨酸發(fā)酵多，由于液氨價(jià)格較貴，為了節(jié)省成本，故一部分氮源采用硫酸銨。通常，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加硫酸銨和發(fā)酵過(guò)程流加硫酸銨兩種方法結(jié)合的方式。（3）生長(zhǎng)因子目前使用的菌株一般是多種缺陷型菌株，如生物素缺陷型、Hse-結(jié)合的菌株，生物素缺陷型、Thr-、Met-結(jié)合的菌株，因此必須根據(jù)菌株缺陷型的情況，在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的生長(zhǎng)因子。（4）無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的組成與配比與谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基類似。參數(shù)控制

溫度：發(fā)酵前期32℃，中后期34℃

pH

：6.5～7.5

種齡和接種量：二級(jí)種子接種量約2%，種齡8～12h

三級(jí)種子接種量10%，種齡6～8h

通風(fēng)供氧：Lys的最大生成量是在供氧充足、細(xì)菌呼

吸充足的時(shí)候單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目三賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)三賴氨酸的提取和精制1.氨基酸:代謝主產(chǎn)物賴氨酸，含量7～8g/L；少量其他氨基酸2.菌體:一般含量在15～20g（干重）/L3.培養(yǎng)基殘留物:殘?zhí)?～20g/L（隨原料不同而異），無(wú)機(jī)離子（如NH4+、Ca2+、Mg2+、K+和一些陰離子，其中NH4+濃度較高。4.色素（一）賴氨酸發(fā)酵液的主要性質(zhì)發(fā)酵液的預(yù)處理，包括去除菌體和影響提取收率的雜質(zhì)離子。鈣離子一般通過(guò)添加草酸或硫酸，生成鈣鹽沉淀而除去（二）發(fā)酵液的預(yù)處理（二）發(fā)酵液的預(yù)處理去除菌體的方法有離心分離法和添加絮凝劑沉淀兩種方法。離心分離法采用高速離心機(jī)（4500～6000r/min）分離除去，菌體小需反復(fù)分離，成本高。添加絮凝劑沉淀法是先將發(fā)酵液調(diào)節(jié)到一定的pH值，加適宜的絮凝劑如聚丙烯酰胺，使菌體絮凝而沉淀，加助濾劑過(guò)濾除去。（三）賴氨酸的提取從發(fā)酵液中提取賴氨酸通常有四種方法：沉淀法有機(jī)溶劑抽提法；離子交換樹(shù)脂吸附法；電滲析法。目前工業(yè)生產(chǎn)均采用離子交換樹(shù)脂吸附法提取賴氨酸從發(fā)酵液中提取賴氨酸常選用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。賴氨酸是堿性氨基酸，等電點(diǎn)（pI）為9.59。在pH=2.0左右能最大程度地被強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附。pH=7.0～9.0被弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附。從發(fā)酵液中提取賴氨酸均選用銨型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。（四）離子交換法提取賴氨酸的工藝條件

離子交換法提取賴氨酸可用三柱串聯(lián)的方式，以提高收率。1.上柱吸附（1）上柱方式上柱方式有正上柱和反上柱兩種。2）交換量正向上柱時(shí)，一般為每噸樹(shù)脂可吸附90～l00kg賴氨酸鹽酸鹽，反向上柱時(shí)可吸附70～80kg賴氨酸鹽酸鹽。流出液pH=5時(shí)表明吸附達(dá)飽和。（3）上柱流速上柱流速應(yīng)根據(jù)上柱液性質(zhì)、樹(shù)脂的性質(zhì)、柱大小及上柱方式等具體情況決定。應(yīng)在小柱中進(jìn)行試驗(yàn)確定合適的上柱流速。一般正向上柱流速大些，可以10L/min的流速吸附；反上柱流速小些。清洗上柱后，需用水洗去停留在樹(shù)脂層的菌體、殘?zhí)堑入s質(zhì)，直至洗滌水清亮，同時(shí)使樹(shù)脂疏松以利洗脫。2.洗脫劑從樹(shù)脂上洗脫賴氨酸所采用的洗脫劑有氨水、氨水十氯化銨或氫氧化鈉等。洗脫劑的濃度對(duì)洗脫效果有影響，一般來(lái)講，為了濃縮需要較高濃度的洗脫劑，為了分離只能用適當(dāng)濃度的洗脫劑。如果洗脫劑濃度太高，達(dá)不到純化的目的。如果洗脫劑濃度太低，洗脫時(shí)間長(zhǎng)，收集不集中，賴氨酸濃度低。使用氨水洗脫時(shí)，一般含量為3.6%～5.4%。如果用5%的氨水洗脫，收集液賴氨酸平均含量可達(dá)6%～8%，洗脫高峰段，賴氨酸鹽酸鹽含量可達(dá)15%～16%。洗脫操作及洗脫液收集，采用單柱順流洗脫，為了使洗脫集中，賴氨酸濃度高，應(yīng)控制好洗脫液流速。一般比上柱流速慢些，多用6L/min的速度洗脫，可根據(jù)柱的大小而異。用茚三酮檢查流出液，當(dāng)有賴氨酸流出時(shí)即可收集。一般為pH=9.5～12，前后流分賴氨酸濃度低而銨含量高，可合并于洗脫用氨水中，以提高收得率。（五）賴氨酸的精制1.濃縮與除氨經(jīng)過(guò)離子交換提取的賴氨酸洗脫液，體積較大，賴氨酸含量較低，約為60～80g/L，還含有較多的氨，約為10～15g/L，因此需要進(jìn)行濃縮和除氨。

（五）賴氨酸的精制1.濃縮與除氨為了收集蒸發(fā)出來(lái)的氨蒸氣，可采用單效蒸發(fā)。蒸發(fā)的主要工藝條件為：溫度70℃以下，真空度0.08MPa左右，加熱蒸汽約為0.02MPa。濃縮液濃縮至19～20°Bé（賴氨酸鹽酸鹽含量約為340～360g/L）放出料液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=4.9，再繼續(xù)濃縮至22～23°Bé。2.賴氨酸鹽酸鹽的結(jié)晶與分離賴氨酸鹽酸鹽濃縮液放入攪拌罐中，攪拌結(jié)晶16～20h，在5℃左右結(jié)晶完畢停止攪拌，用離心機(jī)分離，用少量水洗晶體表面附著的母液。母液經(jīng)濃縮、結(jié)晶、再結(jié)晶，直至不能析出結(jié)晶時(shí)，將母液稀釋，上離子交換柱吸附回收賴氨酸。所得的晶體為賴氨酸鹽酸鹽粗晶體。3.賴氨酸鹽酸鹽的重結(jié)晶與干燥結(jié)晶析出的賴氨酸鹽酸鹽粗晶體含量約為78%～84%，除含有一定水分（15%～20%）外，還含有色素等雜質(zhì)，制造食品級(jí)和醫(yī)藥級(jí)賴氨酸鹽酸鹽需要進(jìn)一步精制純化。單元四氨基酸類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目三賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)

任務(wù)一賴氨酸基本知識(shí)1.賴氨酸的簡(jiǎn)介賴氨酸是人和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的必需氨基酸，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)有重要的影響，且在八種必需氨基酸中是唯一的僅L型成分才能有效利用的基本氨基酸。廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)食品、食品強(qiáng)化劑、飼料及醫(yī)藥等方面。

賴氨酸廣泛存在于動(dòng)物蛋白質(zhì)中，最初賴氨酸的生產(chǎn)是用酸水解酪素，經(jīng)分離谷氨酸后制得，其后又從血粉中提?。ㄘi血粉中賴氨酸含量約9%～10%），但這種方法，工藝比較復(fù)雜，產(chǎn)量受到限制。1960年以來(lái)，日本用營(yíng)養(yǎng)缺陷型的谷氨酸菌株直接發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，其產(chǎn)量不斷擴(kuò)大。20世紀(jì)90年代我國(guó)廣西賴氨酸廠開(kāi)始生產(chǎn)醫(yī)用級(jí)賴氨酸，其產(chǎn)品已被一些藥廠用于制備氨基酸大輸液和賴氨酸與維生素及葡萄糖酸鈣等復(fù)合的口服制劑。目前，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)的L-賴氨酸及其復(fù)合藥有3種：①L-賴氨酸鹽酸鹽顆粒劑；②復(fù)方賴氨酸顆粒劑；③鹽酸賴氨酸注射液。2.賴氨酸的性質(zhì)賴氨酸的化學(xué)名稱為2，6-二氨基己酸具有不對(duì)稱的α-碳原子，故有兩種光學(xué)活性的異構(gòu)體。游離的賴氨酸易吸收空氣中的二氧化碳，故制取結(jié)晶比較困難。

一般商品都是賴氨酸鹽酸鹽的形式。賴氨酸含有α-氨基及ε-氨基，只有在ε-氨基為游離狀態(tài)時(shí)，才能被動(dòng)物機(jī)體所利用，故具有游離ε-氨基的賴氨酸稱為有效氨基酸。故在提取濃縮中，要特別注意防止有效賴氨酸受熱破壞而影響其使用價(jià)值。3.生產(chǎn)菌種賴氨酸的生產(chǎn)方法有抽提法、化學(xué)合成法、酶法以及發(fā)酵法，目前主要以發(fā)酵法生產(chǎn)為主，由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的賴氨酸都是L-賴氨酸。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上主要采用短桿菌屬和棒桿菌屬的各種突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。短桿菌屬有黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌等，棒桿菌屬有谷氨酸棒桿菌。在眾多突變株中，根據(jù)表現(xiàn)型又可分為營(yíng)養(yǎng)缺陷型、敏感型、抗結(jié)構(gòu)類似物及其組合型四類。（1）黃色短桿菌的賴氨酸代謝調(diào)解機(jī)制天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛（ASA)2,3-二氫吡啶-2,6-二羧酸（DDP)L,L–α,ε–二氨基庚二酸L-賴氨酸①②③Δ-呱啶-2,6-二羧酸④⑤①天冬氨酸激酶③DDP合成酶⑥高絲氨酸脫氫酶；⑦琥珀酰高絲氨酸合酶；⑧高絲氨酸激酶；⑨蘇氨酸脫氨酶高絲氨酸琥珀酰高絲氨酸L-蛋氨酸L-蘇氨酸L-異亮氨酸⑥⑦⑧⑨賴氨酸在天冬氨酸系氨基酸中不是優(yōu)先合成，菌體完成蛋氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸的合成后才會(huì)合成賴氨酸。天冬氨酸激酶受到來(lái)自蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制。所以在蘇氨酸限量培養(yǎng)下，即使賴氨酸過(guò)剩，也能形成大量的天冬氨酸半醛。（2）乳糖發(fā)酵短桿菌的賴氨酸調(diào)解機(jī)制非優(yōu)先合成AK受到賴氨酸和蘇氨酸的單獨(dú)的反饋抑制。存在代謝互鎖，其DDP合成酶的合成受到Lue、Cys、Ala的阻遏。代謝互鎖：某一種氨基酸的生物合成途徑受到其他一種完全無(wú)關(guān)的氨基酸的控制。一般在很高的濃度下才能顯示部分抑制或阻遏作用。代謝機(jī)制的改變：優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換或者切斷代謝支路，并解除蘇氨酸和賴氨酸的反饋抑制。（3）選育賴氨酸產(chǎn)生菌①黃色短桿菌高絲氨酸滲漏缺陷型降低高絲氨酸脫氫酶的活性，使代謝流轉(zhuǎn)向優(yōu)先合成賴氨酸。當(dāng)高絲氨酸脫氫酶活力低，所合成的蘇氨酸少，不足以與賴氨酸共同對(duì)天冬氨酸激酶產(chǎn)生協(xié)同反饋抑制作用。實(shí)例：黃色短桿菌No.2247，其高絲氨酸脫氫酶的活力僅為野生菌的1/30，可積累賴氨酸25g/L。缺點(diǎn)：培養(yǎng)基中Thr和Met濃度稍高就會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)造成抑制。②黃色短桿菌高絲氨酸缺陷型使高絲氨酸脫氫酶缺失，切斷通向蘇氨酸和蛋氨酸的代謝流。通過(guò)控制培養(yǎng)液中的高絲氨酸（或蘇氨酸+蛋氨酸）亞適量，控制蘇氨酸濃度，解除協(xié)同反饋抑制。實(shí)例：黃色短桿菌H1013，積累賴氨酸達(dá)42g/L缺點(diǎn)：生產(chǎn)不穩(wěn)定。③黃色短桿菌抗AEC突變株AEC：S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸，為賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物通過(guò)誘變使天冬氨酸激酶編碼的結(jié)構(gòu)基因突變，使天冬氨酸激酶對(duì)賴氨酸或其類似物不敏感，即使在過(guò)量存在蘇氨酸時(shí)，該酶的活性也不受影響。實(shí)例：黃色短桿菌FA-I-23，可積累賴氨酸32g/L注意：?jiǎn)渭兛剐跃a(chǎn)量一般不高，而兼有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，產(chǎn)量會(huì)大幅提高。菌種遺傳特性賴氨酸產(chǎn)量谷氨酸棒桿菌Hse–13g/L黃色短桿菌Thrs+Mets25g/L黃色短桿菌AECr32g/L乳糖發(fā)酵短桿菌AECr29g/L黃色短桿菌AECr+Hse–55g/L鈍齒棒桿菌AECr+Hse–50g/L不同賴氨酸產(chǎn)生菌產(chǎn)酸能力比較④解除代謝互鎖在乳糖發(fā)酵短桿菌中，賴氨酸合成與亮氨酸之間存在代謝互鎖，由丙酮酸向賴氨酸的代謝受阻，導(dǎo)致代謝轉(zhuǎn)向丙氨酸、纈氨酸。選育亮氨酸缺陷型菌株，如(AECr++Leu–，賴氨酸積累量可達(dá)41g/L)選育抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株，如抗AEC+丙氨酸缺陷型+抗2-噻唑丙氨酸，賴氨酸積累量可達(dá)110g/L菌株遺傳標(biāo)記備注谷氨酸棒桿菌Hse-上標(biāo)：-表示缺陷型；s表示敏感型；r表示抗型谷氨酸棒桿菌Hse-、AECr、2-TAr、Urea-Hse—高絲氨酸黃色短桿菌AECrAEC—S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸黃