第六章外源基因的表達(dá)課件

MerryChristmas!第六章

外源基因的表達(dá)1MerryChristmas!第六章

外源基因的表達(dá)1五、酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母（yeast）——是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。2五、酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母（yeast）——是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行酵母菌的特點(diǎn)：基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制比較清楚，遺傳操作相對(duì)簡(jiǎn)便，并于1996年完成了對(duì)釀酒酵母基因組全序列的測(cè)定；具有原核生物所不具備的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾系統(tǒng)；可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；對(duì)人體和環(huán)境安全，不含毒素和特異性病毒；可進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵，工藝簡(jiǎn)單而成熟，成本低廉。3酵母菌的特點(diǎn)：基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制比較清楚，遺傳操作相對(duì)簡(jiǎn)便，1、酵母基因表達(dá)載體酵母克隆和表達(dá)載體是由：酵母野生型質(zhì)粒、原核生物質(zhì)粒載體上的功能基因（如抗性基因、復(fù)制子等）、宿主染色體DNA上自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起構(gòu)建而成。酵母基因表達(dá)系統(tǒng)的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制。41、酵母基因表達(dá)載體酵母克隆和表達(dá)載體是由：4①DNA復(fù)制起始區(qū)酵母表達(dá)載體包含兩類復(fù)制起始序列：在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起始序列在酵母菌中引導(dǎo)進(jìn)行自主復(fù)制的序列5①DNA復(fù)制起始區(qū)酵母表達(dá)載體包含兩類復(fù)制起始序列：在大腸②選擇標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記：它與宿主的基因型有關(guān)。顯性選擇標(biāo)記：可用于各種類型的宿主細(xì)胞，并提供直觀的選擇標(biāo)記。G418：氨基糖苷類抗生素Cycloheximide：蛋白合成抑制劑6②選擇標(biāo)記營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記：它與宿主的基因型有關(guān)。顯性選③有絲分裂穩(wěn)定區(qū)酵母菌表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)少，分子質(zhì)量較大，相當(dāng)于微型染色體。表達(dá)載體上的有絲分裂穩(wěn)定區(qū)，決定載體在宿主細(xì)胞分裂時(shí)，能平均分配到子細(xì)胞中去，它來源于酵母菌染色體著絲粒片段。7③有絲分裂穩(wěn)定區(qū)酵母菌表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)少，分子質(zhì)量較大④表達(dá)盒表達(dá)盒由啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列和終止子等組成，是酵母表達(dá)載體的重要元件。分泌信號(hào)序列是前體蛋白N端一段長(zhǎng)為17～30個(gè)氨基酸殘基的分泌信號(hào)肽編碼區(qū)，主要功能是引導(dǎo)分泌蛋白從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，并對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后的加工起重要作用。8④表達(dá)盒表達(dá)盒由啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列和終止子等組成，是酵母表2、酵母基因表達(dá)載體的種類（1）自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeastreplicatingplasmid，

YRP）該載體含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和基因克隆位點(diǎn)等元件，能夠在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。優(yōu)點(diǎn)：在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化效率較高，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)可達(dá)200個(gè)。缺點(diǎn)：經(jīng)過多代培養(yǎng)后，子細(xì)胞中的拷貝數(shù)會(huì)迅速減少。92、酵母基因表達(dá)載體的種類（1）自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeas（2）整合型質(zhì)粒載體（yeastintegrationplasmid，

YIP）整合型質(zhì)粒載體不含酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母中進(jìn)行自主復(fù)制，但含有整合介導(dǎo)區(qū)，可通過DNA的同源重組將外源基因整合到酵母染色體上，并隨染色體一起進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒與染色體DNA的同源重組主要有單交換（插入）整合和雙交換（或替換）整合兩種方式。10（2）整合型質(zhì)粒載體（yeastintegrationp（3）著絲粒型質(zhì)粒載體（yeastcentromericplasmid，

YCP）該型質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型的基礎(chǔ)上，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件。在細(xì)胞分裂時(shí)，質(zhì)粒載體能平均分配到子細(xì)胞中，穩(wěn)定性較高，但拷貝數(shù)很低，通常只有1～2個(gè)拷貝。11（3）著絲粒型質(zhì)粒載體（yeastcentromeric該載體在酵母細(xì)胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有單拷貝。在細(xì)胞分裂和遺傳過程中，能將染色體載體均勻分配到子細(xì)胞中，并保持相對(duì)獨(dú)立和穩(wěn)定。酵母菌選擇標(biāo)記基因赭石突變抑制基因

SUP4表達(dá)時(shí)菌落呈白色，不表達(dá)時(shí)呈紅色。外源基因的插入可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組轉(zhuǎn)化子。YAC載體可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達(dá)研究。（4）酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）12該載體在酵母細(xì)胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有3、酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌主要包括釀酒酵母*巴斯德畢赤酵母乳酸克努維酵母多型漢森酵母133、酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌主要包括釀酒酵母*巴斯德畢赤酵母乳4、在酵母中高效表達(dá)外源基因的策略選擇合適的受體細(xì)胞系統(tǒng)提高表達(dá)載體在細(xì)胞中的拷貝數(shù)提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平144、在酵母中高效表達(dá)外源基因的策略選擇合適的受體細(xì)胞系統(tǒng)1六、哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是最高等的真核生物細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)、功能和基因表達(dá)調(diào)控更加復(fù)雜。要表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)和具有特異性催化功能的酶，需要在高等真核生物細(xì)胞中進(jìn)行。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)加工等過程。15六、哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是最高等的真核生物細(xì)1、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體的組成特征哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體質(zhì)粒載體病毒載體哺乳動(dòng)物基因表達(dá)質(zhì)粒載體是一類穿梭質(zhì)粒，能夠在細(xì)菌（大腸桿菌）和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。161、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體的組成特征哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體質(zhì)粒載哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體組成元件一般包括：基因的轉(zhuǎn)錄元件：即轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、poly(A)信號(hào)和內(nèi)含子剪接信號(hào)等；用于篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記；在細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制和篩選的元件；基因表達(dá)的調(diào)控元件。17哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體組成元件一般包括：基因的轉(zhuǎn)錄元件：即轉(zhuǎn)錄（1）復(fù)制子表達(dá)載體的復(fù)制子一般采用病毒基因組的復(fù)制子，帶有這些復(fù)制子的表達(dá)載體能以附加體的形式進(jìn)行復(fù)制。通常用于構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的復(fù)制子有SV40、多瘤病毒和牛乳頭瘤病毒等的復(fù)制子。不同表達(dá)復(fù)制子的效率是不相同的。18（1）復(fù)制子表達(dá)載體的復(fù)制子一般采用病毒基因組的復(fù)制子，帶（2）啟動(dòng)子和增強(qiáng)子表達(dá)載體的啟動(dòng)子長(zhǎng)為100～200bp，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游。目前構(gòu)建的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體的啟動(dòng)子，主要來源于病毒。病毒載體的增強(qiáng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，它可大幅度提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。多數(shù)增強(qiáng)子具有宿主特異性。19（2）啟動(dòng)子和增強(qiáng)子表達(dá)載體的啟動(dòng)子長(zhǎng)為100～200bp，（3）終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止和加poly(A)信號(hào)依賴于DNA模板上兩種特異的序列，一是位于poly(A)位點(diǎn)上游11～30個(gè)核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列AAUAAA，二是poly(A)位點(diǎn)下游的GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)。因此，在構(gòu)建表達(dá)載體的時(shí)候必須加上這兩種序列。20（3）終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止和常用的加poly(A)信號(hào)來自SV40，它是一段長(zhǎng)為237bp的BamHI-BclI限制酶酶切片段，它同時(shí)含有早期轉(zhuǎn)錄和晚期轉(zhuǎn)錄單位的切割信號(hào)與加poly(A)信號(hào)。21常用的加poly(A)信號(hào)來自SV40，它是一（4）剪接信號(hào)外源基因的表達(dá)在一級(jí)轉(zhuǎn)錄物加上poly(A)信號(hào)后，內(nèi)含子被剪除并形成成熟的mRNA。mRNA剪接所必需的最短序列位于內(nèi)含子5′和3′邊界上。在構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí)都組入一個(gè)SV40的內(nèi)含子，利用該內(nèi)含子及其剪接信號(hào)構(gòu)建的載體，表達(dá)外源基因的水平比普通的載體要高。若外源基因?yàn)閏DNA，表達(dá)載體中不含內(nèi)含子剪接信號(hào)，也不會(huì)影響其表達(dá)。22（4）剪接信號(hào)外源基因的表達(dá)在一級(jí)轉(zhuǎn)錄物加上poly(A)信（5）選擇標(biāo)記基因?yàn)榱丝焖儆行У睾Y選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞，必須在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)組入動(dòng)物細(xì)胞特異性選擇標(biāo)記基因。目前已發(fā)展的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記如下表所示：23（5）選擇標(biāo)記基因?yàn)榱丝焖儆行У睾Y選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞，必須在24242、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體不帶真核復(fù)制起始序列的質(zhì)粒型載體（整合）帶真核病毒調(diào)控序列元件的質(zhì)粒表達(dá)載體SV40衍生的表達(dá)載體牛乳頭瘤病毒（BPV）衍生載體人皰疹病毒（EBV）衍生的表達(dá)載體人腺病毒（adenovirus）衍生的表達(dá)載體反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）衍生的表達(dá)載體252、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體不帶真核復(fù)制起始序列的質(zhì)粒型載體（整3、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞選擇的基本原則：來源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)效果好。在哺乳動(dòng)物基因表達(dá)過程中，與正常細(xì)胞生理特性盡可能接近的腫瘤細(xì)胞常被選擇為基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞。目前用作哺乳動(dòng)物基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞主要有：CHO-K1細(xì)胞、COS細(xì)胞、鼠骨髓瘤細(xì)胞等。263、哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞選擇的CHO-K1細(xì)胞CHO-K1細(xì)胞——中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮細(xì)胞。目前被用于基因表達(dá)的受體細(xì)胞是一株缺乏二氫葉酸還原酶（dhfr－）的突變株，它可在氨甲蝶呤選擇壓力下，使外源基因拷貝數(shù)擴(kuò)增并得到較高水平的表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)10μg/ml以上。二氫葉酸還原酶可降解氨甲蝶呤氨甲蝶呤可抑制DNA和RNA的合成。27CHO-K1細(xì)胞CHO-K1細(xì)胞——中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮細(xì)胞。①外源基因在沒有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；②適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)；③對(duì)培養(yǎng)基的要求較低，可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；④細(xì)胞可進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，也可進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。該細(xì)胞株是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)受體細(xì)胞之一，已有多種外源基因如人組織型纖溶酶原激活劑（tPA）、干擾素β、干擾素γ、凝血因子Ⅷ等在CHO細(xì)胞中得到表達(dá)。CHO-K1細(xì)胞特點(diǎn)28①外源基因在沒有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；該細(xì)胞株是目前應(yīng)COS細(xì)胞它來源于非洲綠猴腎細(xì)胞系（CV-1），能組成性表達(dá)SV40的大T抗原。COS細(xì)胞的特點(diǎn)：①細(xì)胞來源豐富；②細(xì)胞易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染；③能使轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞中的帶有SV40復(fù)制子的轉(zhuǎn)錄載體快速擴(kuò)增；④能瞬時(shí)大量表達(dá)外源基因的產(chǎn)物。29COS細(xì)胞它來源于非洲綠猴腎細(xì)胞系（CV-1），能組成性表達(dá)由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在COS細(xì)胞中無節(jié)制復(fù)制，最終將導(dǎo)致細(xì)胞無法忍受而死亡。利用COS細(xì)胞作為外源基因瞬時(shí)表達(dá)的受體細(xì)胞可廣泛用于哺乳動(dòng)物基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析等研究。30由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在COS細(xì)胞中無節(jié)制復(fù)制，最終將導(dǎo)致細(xì)胞無法忍受鼠骨髓瘤細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表達(dá)的受體細(xì)胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多種外源基因在鼠骨髓瘤細(xì)胞中得到表達(dá)。鼠骨髓瘤細(xì)胞的特點(diǎn)：①細(xì)胞易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，可在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度懸浮培養(yǎng)；②能進(jìn)行分泌表達(dá)，且表達(dá)量高；③能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾。31鼠骨髓瘤細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞如Sp2/0、NSO和J558L等已4、提高哺乳動(dòng)物基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率的策略（1）設(shè)法提高外源基因的表達(dá)水平和產(chǎn)量（2）改造宿主細(xì)胞的特性（3）抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞周期（4）提高表達(dá)蛋白糖基化水平324、提高哺乳動(dòng)物基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率的策略（1）設(shè)法提高外源七、植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）33七、植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）33第四節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化p389一、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)的過程就是對(duì)特異性mRNA或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。檢測(cè)特異性mRNA的方法Northern雜交法檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)的方法生化反應(yīng)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法生物學(xué)活性檢測(cè)法34第四節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化p389一、基因表達(dá)產(chǎn)1、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)Southern雜交可以檢測(cè)到外源基因是否存在于受體細(xì)胞中，但不能確定外源基因是否轉(zhuǎn)錄。而利用Northern雜交技術(shù)可以檢測(cè)外源基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可采用RT-PCR的方法。351、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)Southern雜交可以檢測(cè)到外源2、報(bào)告基因的酶法檢測(cè)報(bào)告基因必須具備兩大特點(diǎn)：其表達(dá)產(chǎn)物及其功能在未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中并不存在；其表達(dá)產(chǎn)物便于檢測(cè)。362、報(bào)告基因的酶法檢測(cè)報(bào)告基因必須具備兩大特點(diǎn)：其表達(dá)產(chǎn)物及報(bào)告基因一般是編碼酶的基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因工程中：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）等。植物基因工程中：GUS基因、CAT基因、冠癭堿合成酶基因（胭脂堿合成酶基因、章魚堿合成酶基因）、熒光素酶基因和抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。37報(bào)告基因一般是編碼酶的基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因工程中：氯霉素乙酰cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶催化?；梢阴oA轉(zhuǎn)向氯霉素，而乙?；穆让顾夭辉倬哂新让顾氐幕钚?，失去了干擾蛋白質(zhì)合成的作用。真核細(xì)胞不含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，無該酶的內(nèi)源性活性，因而cat基因可作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因及報(bào)告基因。cat基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞能夠產(chǎn)生對(duì)氯霉素的抗性，并可通過對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)來了解外源基因的表達(dá)。cat的活性可以通過反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或反應(yīng)產(chǎn)物乙?；让顾丶斑€原型CoASH的生成來測(cè)定，目前常用的方法有硅膠G薄層層析法及DTNB分光光度法。cat（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶）基因的檢測(cè)38cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶催化?；梢阴oA轉(zhuǎn)向gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因的檢測(cè)gus基因存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，編碼β-葡萄糖苷酸酶，該酶是一種水解酶，能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的gus活性，許多細(xì)菌及真菌也缺乏內(nèi)源gus活性，因而gus基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，尤其在基因外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，gus基因應(yīng)用得最多。常用于gus基因檢測(cè)的底物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）組織化學(xué)染色定位法4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）熒光測(cè)定法對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）分光光度測(cè)定法39gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因的檢測(cè)gus基因存在于某些細(xì)熒光素酶基因的檢測(cè)用作報(bào)告基因的熒光素酶主要來自細(xì)菌或螢火蟲。螢火蟲熒光素酶催化的底物是6-羥基喹啉類，在Mg2+、ATP及O2作用下，酶使底物氧化脫羧，生成激活態(tài)的氧化熒光素，其發(fā)射光子后轉(zhuǎn)變成常態(tài)的氧化熒光素，反應(yīng)中化學(xué)能轉(zhuǎn)變成光能。熒光素＋ATP+O2氧化熒光素＋CO2+AMP+PPi+光螢火蟲熒光素酶細(xì)菌熒光素酶以脂肪醛為底物，需要還原型的黃素單核苷酸及氧參與，使脂肪醛氧化為脂肪酸，同時(shí)放出光子。RCHO+O2+FMNH2RCOOH+H2O+FMN+光細(xì)菌熒光素酶檢測(cè)方法有兩種：活體內(nèi)熒光素酶活性檢測(cè)體外熒光素酶活性檢測(cè)40熒光素酶基因的檢測(cè)用作報(bào)告基因的熒光素酶主要來自細(xì)菌或螢火蟲dhfr（二氫葉酸還原酶）基因的檢測(cè)dhfr基因又稱氨甲蝶呤抗性基因，編碼二氫葉酸還原酶。該酶能催化二氫葉酸還原為四氫葉酸，而四氫葉酸在胸腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。氨甲蝶呤與二氫葉酸結(jié)構(gòu)類似，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶的活性。植物細(xì)胞的二氫葉酸還原酶對(duì)氨甲蝶呤極為敏感，而來自于細(xì)菌或小鼠的二氫葉酸還原酶對(duì)氨甲蝶呤的敏感性很低。用細(xì)菌的二氫葉酸還原酶作為報(bào)告基因，可使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在一定濃度的氨甲蝶呤培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞則不能生長(zhǎng)。41dhfr（二氫葉酸還原酶）基因的檢測(cè)dhfr基因又稱氨甲蝶呤3、免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)免疫沉淀法*酶聯(lián)免疫吸附法Western沉淀法*固相放射免疫法（抗原-抗體）423、免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)免疫沉淀法*酶聯(lián)免疫吸附法Weste免疫沉淀法可應(yīng)用于表達(dá)產(chǎn)物的定性與定量分析。優(yōu)點(diǎn)：選擇性好，靈敏度高，可檢測(cè)出100pg水平的放射性標(biāo)記蛋白，并可從蛋白質(zhì)混合物中提純出抗原－抗體復(fù)合物。43免疫沉淀法可應(yīng)用于表達(dá)產(chǎn)物的定性與定量分析免疫沉淀法的步驟：①對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。②細(xì)胞裂解。③形成特異性免疫復(fù)合物。④靶蛋白的免疫沉淀。⑤蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。44免疫沉淀法的步驟：①對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。44酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）ELISA是一種利用免疫學(xué)原理檢測(cè)抗原、抗體的技術(shù)。它與經(jīng)典的以同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的液－液抗原－抗體反應(yīng)體系不同之處是建立了固－液抗原－抗體反應(yīng)體系，并采用酶標(biāo)記?？贵w與抗原的結(jié)合通過酶反應(yīng)來檢測(cè)。由于酶反應(yīng)的放大作用，使測(cè)定的靈敏度極高，可檢出1pg的目的物。同時(shí)酶反應(yīng)還具有很強(qiáng)的特異性。因此ELISA是基因表達(dá)研究中不可缺少的方法。除了可溶性抗原（抗體）之外，ELISA還可以檢測(cè)含表面抗原的細(xì)胞。45酶聯(lián)免疫吸附法ELISA是一種利用免疫學(xué)原理檢測(cè)抗原、抗體的ELISA檢測(cè)外源基因表達(dá)蛋白的四個(gè)步驟：①抗體制備（普通抗體、酶標(biāo)記抗體[一抗、二抗]）②抗體或抗原的包被(固定在固相載體上）③免疫反應(yīng)④特異性表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)46ELISA檢測(cè)外源基因表達(dá)蛋白的四個(gè)步驟：①抗體制備（普通抗47474848示意圖ELISA用血清來檢測(cè)49示意圖ELISA用血清來檢測(cè)49Western印跡法Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測(cè)定融為一體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。它具有很高的靈敏性，可從植物細(xì)胞總蛋白中檢測(cè)出50ng的特異蛋白質(zhì)。若是提純的蛋白質(zhì)，可檢至1～5ng。50Western印跡法Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和原理：轉(zhuǎn)化的外源基因正常表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中含有一定量的目的蛋白。從細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位印跡到固相膜上，膜在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉非特異性位點(diǎn)。然后加入特異抗體（一抗），印跡上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一結(jié)合的標(biāo)記的二抗，最后通過二抗上標(biāo)記化合物的性質(zhì)進(jìn)行檢出。51原理：轉(zhuǎn)化的外源基因正常表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因細(xì)Western印跡法的五個(gè)步驟：①轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)的提取②SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)③蛋白質(zhì)條帶印跡④探針制備⑤雜交52Western印跡法的五個(gè)步驟：①轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)的提取524、表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測(cè)當(dāng)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種酶蛋白時(shí)，可根據(jù)酶的催化反應(yīng)來確定外源基因表達(dá)與否和表達(dá)的程度。該方法簡(jiǎn)便且易于操作，在反應(yīng)體系中加入特定的底物和基因表達(dá)產(chǎn)物的抽提物就可根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行定性和定量的分析。534、表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測(cè)當(dāng)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種酶蛋白時(shí)二、基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化的步驟：細(xì)胞破碎離心分離柱層析電泳54二、基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化的步驟：細(xì)胞破1、細(xì)胞的破碎對(duì)于進(jìn)行分泌型表達(dá)的細(xì)胞來說，這一步可以省略。對(duì)于非分泌型表達(dá)的細(xì)胞可采用不同的細(xì)胞破碎方法。常見的細(xì)胞破碎方式變性劑裂解法（SDS、NP40）超聲波破碎法機(jī)械破碎法酶裂解法（降解）551、細(xì)胞的破碎對(duì)于進(jìn)行分泌型表達(dá)的細(xì)胞來說，這一步可以省略。2、離心離心力一般在數(shù)萬g范圍以內(nèi)，主要用來去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞壁碎片等；高速離心：超速離心：離心力一般100,000g以上，可用來去除細(xì)胞膜碎片等高分子復(fù)合物。附：離心力和轉(zhuǎn)速的換算公式：RCF=11.18×(N/1000)2×rRCF：相對(duì)離心力，單位為重力加速度gN：轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)速度（轉(zhuǎn)速），用r/min表示r：轉(zhuǎn)頭半徑，為離心管中軸底部?jī)?nèi)壁到離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心的距離，單位為厘米（cm）562、離心離心力一般在數(shù)萬g范圍以內(nèi)，主要用來去除未破碎的細(xì)3、特異性表達(dá)蛋白的初步分離沉淀法：超濾濃縮法：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同而進(jìn)行初步分離的一種方法（濾膜過濾）。簡(jiǎn)便有效，能處理大量的樣品、并除去大量的雜蛋白。常用硫酸氨或有機(jī)溶劑對(duì)離心后的樣品進(jìn)行分步沉淀。該法也常用于蛋白質(zhì)的濃縮。573、特異性表達(dá)蛋白的初步分離沉淀法：超濾濃縮法：根據(jù)蛋白質(zhì)分4、柱層析包括凝膠柱層析、離子交換層析、吸附層析、金屬螯合層析、共價(jià)層析、疏水層析、親和層析等。584、柱層析包括58層析的基本原理：所有的層析系統(tǒng)都是由互不相容的兩相組成，一個(gè)是固定相即層析介質(zhì)，一個(gè)是流動(dòng)相。利用混合溶液中蛋白質(zhì)分子的理化特性差異（如吸附力、分子形狀大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在兩相中，并以不同的速