大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取-(堿法)課件

實(shí)驗(yàn)

一

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取(堿法)實(shí)驗(yàn)一

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取(堿法)1背景知識(shí)質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。背景知識(shí)質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到22質(zhì)粒特點(diǎn)：質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命。質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，是細(xì)菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。質(zhì)粒類型：按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒質(zhì)粒特點(diǎn)：質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是31.松弛型質(zhì)粒

松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。

2.嚴(yán)緊型質(zhì)粒

嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個(gè)質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過(guò)用氯霉素等蛋白合成抑制劑來(lái)增加。

1.松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼4質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。5一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解堿法提取質(zhì)粒的原理；2.掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理

使蛋白質(zhì)或脂類等菌體成分變性基因組DNA產(chǎn)生缺刻，變成線狀，并解離成單鏈（變性）由于質(zhì)粒DNA較小，仍為環(huán)狀變性區(qū)雖大，但不分離

利用強(qiáng)堿（或加熱）及表面活性劑(SDS)裂解菌體中和或恢復(fù)至室溫變性的質(zhì)粒DNA按原互補(bǔ)配對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)性基因組DNA隨機(jī)復(fù)性，與蛋白質(zhì)等菌體成分結(jié)合在一起離心分離質(zhì)粒DNA存在于上清中，回收苯酚/氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀純化二、實(shí)驗(yàn)原理使蛋白質(zhì)或脂類等菌體成分變性利用強(qiáng)堿（或加熱7二、實(shí)驗(yàn)原理

堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們的。在堿性pH，DNA變性，當(dāng)恢復(fù)中性并在高鹽離子濃度時(shí)，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中；而線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，相互交聯(lián)纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得含有大量質(zhì)粒的上清液，利用親水性有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、PEG8000）使質(zhì)粒DNA脫水，離心后收集。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：超螺旋、開環(huán)和線狀二、實(shí)驗(yàn)原理堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)8三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌、LB液體培養(yǎng)基（三）試劑：溶液I：25mMTris·HCl(pH8.0),10mMEDTA(Ph8.0)，50mMGlucose；溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配；

作用:細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解,核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III:3MKOAc，5MCH3COOH；

作用:酸性下質(zhì)粒DNA非特異性復(fù)性，變性蛋白－SDS＋線性DNA沉淀三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、9平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）

作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫）

注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無(wú)水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試101、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mlEP管中,4℃下6000g離心2min。

2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。

3、菌體沉淀重懸浮于200μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩,充分搖勻)。

4、加入新配制的400μl溶液Ⅱ(新鮮配置：0.4MNaOH和2%SDS儲(chǔ)液各取等體積混勻后加入),蓋緊管口，溫和顛倒離心管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴3分鐘。

5、加入300μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，溫和顛倒離心管振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。

四、操作步驟

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mlEP管中,4℃下60011四、操作步驟6、上清液（700μl左右）移入干凈EP管中,加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5min。7、將水相（上清）（500μl左右）移入干凈EP管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中15分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次。9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液或者滅菌水(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

四、操作步驟6、上清液（700μl左右）移入干凈EP管中,加12

堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液I13五、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）五、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)14五、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)。培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。變性的時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。復(fù)性時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染。對(duì)于細(xì)胞壁較厚的菌（如酵母菌）質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。五、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)。15五、注意事項(xiàng)——核酸分離、純化采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法五、注意事項(xiàng)——核酸分離、純化16五、注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解（TE中的EDTA能螯和Mg2+或