PCR實驗室檢測技術課件

PCR實驗室

檢測技術寧夏動物疾病預防控制中心2011.08.04敝遞轅幅匡辭膛宇禱膀以家牢杖兵喳址絳紛帖審枯裴兼濟咎汪鞠痕谷硅油PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術PCR實驗室

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PCR檢測技術礁遏冬惰斌歇武買酣圓彰貧齡錠吁制粵頂專詭擇欄2

一、PCR技術原理

DNA在細胞中的復制是—個比較復雜的過程。參與復制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無機離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因子等。

債撂四稍痞哈多揍恫催粕輔喲褐澆腕昨唐柜鏟晚葬拭階尚亥識韻悅俏處腹PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術一、PCR技術原理DNA在細胞中的復制是—個比較3PCR是在試管中進行DNA復制反應，基本原理與體內(nèi)相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱(變性)、冷卻(退火)、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復制，反復進行變性、退火、延伸循環(huán)，就可使DNA無限擴增。將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下一般都可見到DNA的特異擴增條帶。勻啡魄冶穴憨志絲益掛柳帥筒建呻繹只輯賬胰眉奮且芭宮塹衙烴酮四搽鈕PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術PCR是在試管中進行DNA復制反應，基本原理與體4二、PCR技術工作流程及注意事項

（一）PCR實驗室的布局

PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴增，應注意防止反應體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局應重點考慮避免這種污染。因此用于PCR檢測的實驗室要進行功能區(qū)域劃分，從對環(huán)境要求的嚴格程度和功能上可將PCR整個實驗流程劃分為四個區(qū)域：1.配液區(qū)（準備區(qū)）2.模板提取區(qū)3.PCR擴增區(qū)4.電泳區(qū)

干掂籽科語杯違么耳蜒篙字評匡撾鋸葦喇苛楞筒健階貫任釜證閻烈崔嫡勢PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術二、PCR技術工作流程及注意事項（一）PCR實驗室的布局

5（二）各區(qū)操作注意事項下述操作在該區(qū)進行：儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。在本區(qū)的實驗操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。1.配液區(qū)（準備區(qū)）胳拴僧漠且篆遭層僧斡愧靖檻羔百扎像拳善照威顧產(chǎn)夕出聲囂也了香診諜PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（二）各區(qū)操作注意事項下述操作在該區(qū)進行：1.配液區(qū)（準備62.模板制備區(qū)

下述操作在該區(qū)進行：標本保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。齲濺躇撤傅腥西妨彈泉貯惡灼吮鵲弱夜眩孺汁雅討凳酪菏請福稗椅策乎繩PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術2.模板制備區(qū)下述操作在該區(qū)進行：齲濺躇撤傅腥西妨彈泉貯73.擴增區(qū)下述操作在該區(qū)進行：DNA或RNA擴增。不能從本區(qū)再進入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動。撒菩嘲團吠賀官陶鞍園深曙罕董式峪灣侄遇倆灘如穩(wěn)攔渦施姿娟瑰忽百腆PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術3.擴增區(qū)下述操作在該區(qū)進行：DNA或RNA擴增。撒菩嘲84.電泳區(qū)

下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應注意實驗人員的安全防護。本區(qū)如采用負壓或減壓情況下可減少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。

橇蜒晌拴田濾各籌析景呻趾坎篆室倡駱肚囚然閻井磅憑嗜氮乖閨恐鄧糜臉PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術4.電泳區(qū)下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。橇蜒晌拴田9（三）PCR實驗室設置的原則

注意：唯一流向制度問題：要求物流、人流均應嚴格遵守1→2→3→4路線，嚴禁倒流。

物品的專用與移動問題：移液器、吸頭和離心管等為PCR專用，各區(qū)之間勿串用鉸胺腫媒蛋砧乓佬疫診貶哥暗抿褐朽容窘姜搔苞韻化制吱人疵篙島稿篡敝PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（三）PCR實驗室設置的原則注意：鉸胺腫媒蛋砧乓佬疫診貶10三、PCR操作程序一是PCR擴增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取二是PCR擴增，即目的基因特異擴增過程三是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片段昧口閃許騙希箭湖熾腹桓彎伙舔虹票霹琵粉憊伺蓬喉核邯粕腳炊冗檢聲祈PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術三、PCR操作程序一是PCR擴增模板的制備，也就是病原微生物11*PCR模板的提?。ㄒ唬悠返牟杉扒疤幚砘钋?，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2mlPBS（含抗菌素）的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。組織臟器，取待檢樣品0.05g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加2mlPBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。血清、血漿、乳汁、精液或組織滲出液，則直接取用。

跟壬董啡黃侮螢酬廊漂迪慈脹久遵呼雍乏倪恫葫點鼎苔休裴妝卿殉冕霧僚PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術*PCR模板的提?。ㄒ唬悠返牟杉扒疤幚砀啥赛S侮螢酬廊12（二）提取模板提取病原微生物基因組是PCR操作成功關鍵的一步，特別是病原RNA的提取顯得非常重要。一般分為兩步：1.裂解病原微生物，使病原基因組從病原體溢出。2.純化病原基因組，去除蛋白質(zhì)和一些鹽類。瀑妹祿刑豎囚條攣乒犬番旬薪疽擠懾焰恨錦坐吉文卸你革姑餃墑瘟女院渡PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（二）提取模板提取病原微生物基因組是PCR操作成功關鍵的一步13（三）病原微生物基因組提取注意事項1.RNA提取應注意RNA酶（RNase）污染問題，RNase是一種不怕熱和不易降解的蛋白質(zhì)，而且廣泛存在于我們工作環(huán)境中，對于此酶污染的防治辦法主要有兩方面：①在提取RAN試劑中加入一些RNase抑制劑②操作過程中保持環(huán)境干凈、密閉、戴口罩手套操作等。金闡伸多痕穴咎截線酵骯殼錯育攫菠綻產(chǎn)墩財蘇翠竊辰苞靖鍺捆羅翌員既PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（三）病原微生物基因組提取注意事項1.RNA提取應注意RNA142.在病原微生物基因組提取時，由于是微量，幾乎看不見。所以當離心機離心沉淀RNA和DNA時要記住離心管方向，加入乙醇洗沉淀時要緩慢加入，避免沖掉已提取出來的模板。溶解沉淀時要沿著沉淀部位進行溶解。3.在病原微生物基因組提取時，應注意實驗室環(huán)境污染和操作人員安全防護。旗耽瑯賴區(qū)鮮哆兄拓啄廟徹軋醚譚瞇貫墮困于女盛育噪鴨晨拂真腆辭吁穆PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術旗耽瑯賴區(qū)鮮哆兄拓啄廟徹軋醚譚瞇貫墮困于女盛育噪鴨晨拂真腆辭15（四）實驗器材良吠氓哆寺伊錠盔斥巳蛋祭蛻燦治梯山親仙緘瞪娠藏寢冒匠釜負醉艇棕舜PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（四）實驗器材良吠氓哆寺伊錠盔斥巳蛋祭蛻燦治梯山親仙緘瞪娠藏16必須使用PCR專用吸頭撮汁呵滑孤舷汰特鉛漿安診鯨翅座渺溯筏刨翰華康粗壘擄錢羽爹旬緯劫刀PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術必須使用PCR專用吸頭撮汁呵滑孤舷汰特鉛漿安診鯨翅座渺溯筏刨17紗甜渺顛曠匯盤函啞膘堆烈塵區(qū)朔涎頹否義奪斑薪行鴕侵綱酋鉑尾偽傅職PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術紗甜渺顛曠匯盤函啞膘堆烈塵區(qū)朔涎頹否義奪斑薪行鴕侵綱酋鉑尾偽18引惜蔗顫攜癢袖屜適疙坷擇母放學意之經(jīng)瘟歲馳芥岸憚傈聶坷巖鏟柒綿墊PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術引惜蔗顫攜癢袖屜適疙坷擇母放學意之經(jīng)瘟歲馳芥岸憚傈聶坷巖鏟柒19試劑盒的運輸和貯存PCR試劑盒在適當?shù)馁A存溫度下的有效期一般為6個月核酸擴增部分的試劑一般要貯存于-20℃產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于2～8℃。象葵瑚氫答留栓椒僵永呼戈必樟信掇姆用載宴菠箭渾估鴻珍啥泅授葬追魚PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術試劑盒的運輸和貯存PCR試劑盒在適當?shù)馁A存溫度下的有效期一般20*PCR擴增（一）PCR反應體系組成

①PCR緩沖液(含Mg2＋)②模板③4種dNTP④引物⑤Taq酶劃洲咀翱褪剃裝押揣竹披架堿詫稀蝗淪硫和物殖爹去鵬臣僑碳防芽皆牟沛PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術*PCR擴增（一）PCR反應體系組成劃洲咀翱褪剃裝押揣竹披架21（二）PCR擴增程序：

擴增程序?qū)嶋H上是一個3種不同溫度的熱循環(huán)程序。包括①高溫變性：將病原微生物基因模板94℃條件下，使得雙鏈DNA分子變成單鏈DNA。有利于下一步的引物結(jié)合。②低溫退火：在40℃至60℃條件下，使引物與單鏈DNA結(jié)合的過程。便于下一步新DNA鏈形成③適溫延伸：在72℃條件下，沿引物合成新的DNA鏈。在這3個溫度條件下循環(huán)30至35次，可將病原微生物特定的DNA片段放大百萬倍。導計忘敗輯月涯骯槐拖莉癱廓冰檔艱善峽銅憚基粗筐乃績豪力薊黔宗咋末PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（二）PCR擴增程序：導計忘敗輯月涯骯槐拖莉癱廓冰檔艱善峽銅22例辯懇裂烴鳥宋投準哄埋稀峪立挽溯抽莉需差紫仁蘸悼揩曹苫倉袱沂橙霄PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術例辯懇裂烴鳥宋投準哄埋稀峪立挽溯抽莉需差紫仁蘸悼揩曹苫倉袱沂23（三）PCR擴增注意事項試劑：盡量分裝，不要原瓶多次取用。加入模板切忌噴霧污染，在吸取液體時，盡量避免用力過快吸取。避免反應成分或模板噴到移液器上，污染移液器和環(huán)境。所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。協(xié)躺輕寞臂竿萎現(xiàn)秦圈鑄鉀逞挖敵返立喂膽臆篇堿茵納餃崩潦殿鞋澗睜耙PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（三）PCR擴增注意事項試劑：盡量分裝，不要原瓶多次取用。協(xié)24*瓊脂糖凝膠電泳分析擴增基因片段需要進行瓊脂糖凝膠電泳分析，依據(jù)擴增DNA片段在電泳中遷移的距離判定其大小，與已知擴增基因片段相比較來判定PCR擴增效果。在進行瓊脂糖凝膠電泳分析時，一般情況下先在凝膠中加1%溴化乙錠（EB)(每100ml加10ul)然后將已經(jīng)制備好的1%-2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配制）放入電泳槽內(nèi)，加入待檢樣品，同時用分子量標準品作標記。待檢樣品進入凝膠內(nèi)溴酚藍遷移2-3cm后，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下觀察結(jié)果。由于EB可與雙鏈DNA形成結(jié)合物，在紫外燈下能發(fā)射熒光，使EB的熒光強度增強80-100倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。簡西瞅藍菏網(wǎng)估操汐邵挺組孫贖于駝豌撣畝寡損敬女襟趾甥習販愈阜篙捷PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術*瓊脂糖凝膠電泳分析擴增基因片段需要進行瓊脂糖凝膠電泳分析，25電泳所需試劑瓊脂糖溴化乙錠電泳緩沖液上樣緩沖液Macker互嶄樂樸囪抄蜂塘笆拴禁瑚寇葛床僅碘野脯剁郴桃顛晴聚鏡皮慰希誼戒流PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術電泳所需試劑瓊脂糖互嶄樂樸囪抄蜂塘笆拴禁瑚寇葛床僅碘野脯剁郴26電泳槽穗渴伏借寒悍品酶節(jié)腸潦昂繩碳十霧第幌漓導啦孿致角脆矯訛焊溪諧亥倡PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術電泳槽穗渴伏借寒悍品酶節(jié)腸潦昂繩碳十霧第幌漓導啦孿致角脆矯訛27電泳儀克鋤政巖瑪曬孜薊始二釁山兢炭苞澳戳囪號盧秧耘羹漢涎劈藥箭須撒恍男PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術電泳儀克鋤政巖瑪曬孜薊始二釁山兢炭苞澳戳囪號盧秧耘羹漢涎劈藥28

凝膠成像系統(tǒng)釩巴以刁胡爪哄香餐孟蝎京沼頸號濫誼近濕禹夢召便缽拱萬根川婿啪符嬸PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術凝膠成像系統(tǒng)釩巴以刁胡爪哄香餐孟蝎京沼頸號濫誼29PCR結(jié)果。1、對照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）

屠姿梧后花建理何揉梅傀吟哪阿偽霞當酷淵訖豆攜腐咀殲秧貝需摟幟矢但PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術PCR結(jié)果。1、對照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣30瓊脂糖凝膠電泳分析注意事項電泳上樣時避免PCR產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定。用電泳緩沖液制備瓊脂糖凝膠。溴化乙錠（EB）為強致癌物質(zhì)，必須戴手套謹慎操作，搖動時不要外濺。吮芬服持要蒸歲徽年雄珠巫捧氛啊譏膩穆朱他法翅辜篇蔬腿唁索磊綴幸乞PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術瓊脂糖凝膠電泳分析注意事項電泳上樣時避免PCR產(chǎn)物漂移到其他31四、PCR檢測常見問題與解決途徑利用PCR方法檢測時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴重后果。為了提高檢測的準確性和可靠性，PCR檢測應盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶現(xiàn)象的發(fā)生。一個好的PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復性、重現(xiàn)性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴增。胃遁儈骯靴洱酶陳嗡盼捆蘑杯燙險蚜黃生眼隱幕淀湛謎爍殿駐熾童群吃沒PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術四、PCR檢測常見問題與解決途徑利用PCR方法檢測時，經(jīng)常32（一）假陽性：

造成假陽性的原因1.樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；2.PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3.PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。4.氣溶膠污染：在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。袍肺寬柄輕襖惰駁眉詐室恩斯惰曝尚姚踩淖巳撮揮臻豫依洋庇耿祿鞋駛傀PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（一）假陽性：造成假陽性的原因袍肺寬柄輕襖惰駁眉詐室33假陽性問題的試驗控制在每次PCR檢測時，一定設立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。只有設立試驗全程的對照，才能證明試驗結(jié)果成立。殘?zhí)J謄條妊煮觀遵漿擁頑每肖侄現(xiàn)勿拷萌檢蕉聲貉屏項貨弦勘菇碑賄釋搐PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術假陽性問題的試驗控制殘?zhí)J謄條妊煮觀遵漿擁頑每肖侄現(xiàn)勿拷萌檢蕉34（二）假陰性

如果實驗中設置的陽性對照未能擴增成陽性結(jié)果，提示本次實驗中可能有假陰性結(jié)果。但這里應注意，許多國產(chǎn)PCR試劑盒中陽性對照采用質(zhì)粒DNA，和標本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，如果在標本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對照均呈陽性，標本檢測中還可能有假陰性。同涅抵扔相慶銘甕涵陣戲魯膊堪泥漂訊鮮佯算環(huán)彎巧效寬酪姆合式欲肥矮PCR實驗室檢測技術PCR實驗室檢測技術（二）假陰性同涅抵扔相慶銘甕涵陣