基因打靶技術(shù)

基因打靶技術(shù)第1頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶研究背景基因轉(zhuǎn)移技術(shù)顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染等導入的外源基因在靶細胞基因組中整合的位點一般是隨機的可能導致下面幾種情況出現(xiàn)：①導入的外源基因整合入某一正?；虻闹胁?，導致該正?；虮磉_的缺失；②導入的外源基因整合入細胞內(nèi)正?；虻膫?cè)翼序列，影響了其周圍正?；虻幕钚?；③外源基因的導入有可能激活細胞內(nèi)的原癌基因；④導入的外源基因由于其整合位點的不適，而在細胞內(nèi)不表達或表達難以控制。解決辦法：將外源基因?qū)腩A先確定的位點。

即對細胞內(nèi)靶位點進行定點修飾——基因打靶，第2頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是基因打靶？基因打靶（genetargeting）是指外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合在預定位點，改變細胞遺傳特性的方法

建立在胚胎干細胞（embryonicstemcell，ES細胞）與同源重組技術(shù)基礎(chǔ)之上的基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段第3頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶原理生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅實的理論基礎(chǔ)，而胚胎干細胞技術(shù)的發(fā)展，促進了基因打靶的廣泛應用。同源重組(Homologousrecombination)又稱一般性重組或非特異性重組(Generalrecombination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過程,外源DNA片段可與宿主基因組的相應片段發(fā)生交換（即重組）。ES細胞是一類具有在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細胞類型的細胞。第4頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/8/4蘇州科技學院生物系葉亞新第5頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶的原理第6頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶的主要步驟重組基因載體的構(gòu)建導入受體細胞篩選檢測第7頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶的主要步驟打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標記基因等。基因打靶載體：基因插入型載體(Gene-insertionvector)：插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點，線性化后，同源重組導致基因組序列的重復，從而干擾了目標基因的功能?；蛑脫Q型載體(Gene—replacementvector)：置換型載體進行線性化的酶切位點在引導序列和篩選基因外側(cè)，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進行基因打靶。第8頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶的主要步驟2、外源DNA導人的方式

外源DNA導人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應用最廣的是顯微注射法。顯微注射每次只能注射一個細胞；電穿孔法可同時使許多細胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1％的ES細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細胞有特異的親合力，可用于時空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

第9頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月3.基因打靶的篩選方法（1）正負雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)解決了定點整合與隨機整合的鑒別問題。同源重組時，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內(nèi)。正選擇基因多為neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機整合和同源重組中均可正常表達。負選擇基因常用HSV-tk基因，在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3’末端，在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，在隨機整合時，所有的序列均保留（包括tk）。第10頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月3.基因打靶的篩選方法（1）正負雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)

無毒的丙氧鳥苷（GANC）毒性核苷酸殺死細胞篩選排除隨機整合的細胞株。同源重組時，G418和GANC都有抗性，隨機整合時對G418有抗性，但對GANC敏感，細胞將被殺死，無整合的將被G418殺死。

用G418作正篩選，選出含有neo基因的細胞株，再用丙氧鳥苷作負篩選淘汰含有tk基因的細胞株，保留未含有tk基因的同源重組細胞株。胸苷激酶蛋白（TK）第11頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/8/4蘇州科技學院生物系葉亞新第12頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月基因打靶的篩選第13頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月3.基因打靶的篩選方法（2）正相選擇法（positiveselectionmethod）主要程序：將標記基因neor的啟動子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點同源的序列內(nèi)，將打靶載體轉(zhuǎn)染進靶細胞，

可能出現(xiàn)下面幾種情況：①打靶載體不整合入靶細胞基因組，將隨傳代而丟失；②外源打靶序列隨機整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動子和起始密碼，整合位點周圍亦無啟動子，使neor基因的表達受阻；③雖是隨機整合，但其整合位點側(cè)翼序列在其它基因的啟動子能啟動neor基因的表達；④外源打靶載體與靶位點發(fā)生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的啟動子和起始密碼的作用而呈現(xiàn)表達活性。

因此，如用G418篩選，則抗性細胞中將只包含后兩種可能情況，根據(jù)這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測出同源重組的克隆。第14頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月4.基因打靶的策略完全基因剔除(completeknotk-out)的策略大規(guī)模隨機基因剔除—基因捕獲(genetrapping)精細突變的引入條件性基因打靶打了就走策略(HitandRun法)“標記和置換”法(TagandExchange)第15頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月4.基因打靶的策略借助于陽性選擇標記基因通常被插入靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實行靶基因的完全剔除。陽性選擇標記基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），將其以正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基因外，通過分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表達的時空順序。完全基因剔除(completeknotk-out)的策略第16頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月4.基因打靶的策略可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫，neo基因插入到ES細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得。

在單次實驗中可以獲得數(shù)以百計的帶有單基因剔除的ES克隆。但此方法的缺點是只能剔除在ES細胞中表達的基因。第17頁，課件共19頁，創(chuàng)作于2023年2月4.基因打靶的策略這一方法包括兩次同源重組：第一步（Hit）用插入型載體進行同源重組，這樣會在靶位點插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個篩選標記（如正篩選標記基因neo和負篩選標記基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性篩選，富集為數(shù)不多的發(fā)生了染色體內(nèi)重組的克隆。染色體內(nèi)重組去除了含有負篩選標記基因的載體序列，由于負篩選標記基因的消失，細胞就恢復了對負篩選藥物的抗性，因此，回復突變體可以在負選擇培養(yǎng)基中存活下來。第18頁，課件共1