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細(xì)菌生化反響鑒定及其它試驗(yàn)操作規(guī)程細(xì)菌生化反響鑒定及其它試驗(yàn)操作規(guī)程1、氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(O-F原理:細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中,必需有分子氧參與的,稱為氧化型。可以進(jìn)展無(wú)氧降解的,稱為發(fā)酵型(發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無(wú)氧的條件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。方法:將待檢細(xì)菌同時(shí)穿刺接種兩支Hugh-Leifson培育基,其中一支培育基滴加無(wú)菌石蠟(或其它礦物油),高度不少于lcm。35℃,24結(jié)果:培育基變黃表示細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸,兩支培育基均無(wú)變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型;兩支培育基均均產(chǎn)酸為發(fā)酵型。假設(shè)僅不加石蠟的培育基產(chǎn)酸為氧化型。應(yīng)用:主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵細(xì)菌的鑒別,前者均為發(fā)酵型,而后者均為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌問(wèn)的鑒別。2、β-半乳糖苷酶(ONPG)試驗(yàn)原理:細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶,分解鄰-硝基酚β-D-半乳糖苷(無(wú)色)生成鄰-硝基酚(黃色)。結(jié)果:菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性反響,一般在20-30分鐘內(nèi)顯色。應(yīng)用:主要用于緩慢發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。3、七葉苷水解試驗(yàn)原理:有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素,七葉素與培育基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反響,生成黑色的化合物。結(jié)果:培育基變黑為陽(yáng)性,不變色為陰性。應(yīng)用:主要用于D群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別。前者為陽(yáng)性,后者為陰性。也可用于革蘭陰性菌與厭氧菌的鑒別。4.甲基紅試驗(yàn)原理:某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中,分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步分解,產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等,使培育基pH值降至4.5以下,參加甲基紅呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。假設(shè)細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸少,或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物,則培育基pH值仍在6.2以上,參加甲基紅呈現(xiàn)黃色為陰性。結(jié)果:呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性,橘紅色為弱陽(yáng)性。黃色為陰性。應(yīng)用:主要用于鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌,前者陽(yáng)性,后者陰性。此外腸桿菌科中變形桿菌屬、沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬和志賀菌屬等陽(yáng)性,而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。5、VP原理:某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中,氧化為二乙酰,與精氨酸中的胍基作用生成紅色化合物。結(jié)果:在數(shù)分鐘內(nèi)消滅紅色為陽(yáng)性,如無(wú)紅色消滅且于35℃4h后仍如故者即為陰性。應(yīng)用:本試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)一起使用,由于前者陽(yáng)性的細(xì)菌,后者通常為陰性。6、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)原理:細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚(靛基質(zhì)),參加對(duì)位二甲基苯甲醛生成紅色玫瑰吲哚。結(jié)果:于兩者液面接觸處消滅紅色為陽(yáng)性,無(wú)色為陰性。應(yīng)用:主要用于腸桿菌科的鑒定。6、尿素分解試驗(yàn)原理:具有尿素酶(尿酶)的細(xì)菌,分解尿素產(chǎn)生大量的氨,培育基變堿。結(jié)果:培育基呈堿性,使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性,不變色為陰性。應(yīng)用:主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定,奇異變形桿菌、一般變形桿菌為陽(yáng)性,克雷伯菌屬、枸椽酸菌屬、雷氏普羅威登菌和摩根摩根菌為陽(yáng)性。7、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)原理:某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨生成苯丙FeCl3結(jié)果:消滅綠色為陽(yáng)性,應(yīng)馬上觀看結(jié)果,延長(zhǎng)會(huì)引起退色。應(yīng)用:主要用于腸桿菌科的鑒定,變形桿菌屬、普羅威登斯菌和摩根摩根菌均為陽(yáng)性。腸桿菌科其它菌均為陰性。8、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)原理:具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌,分解氨基酸脫羧生成胺和CO2使培育基變堿,指示劑轉(zhuǎn)變顏色。結(jié)果:比照管應(yīng)呈黃色,測(cè)定管呈紫色(指示劑為溴甲酚紫)為陽(yáng)性。應(yīng)用:主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。9、氧化酶試驗(yàn)原理:氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌,首先使細(xì)胞色素C氧化,再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二氨氧化。生成有色醌類化合物。結(jié)果:細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈紫色為陽(yáng)性。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性,應(yīng)作陰、陽(yáng)性比照。應(yīng)用:主要用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別,前者為陰性。后者為陽(yáng)性。10、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))原理:具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌,能催化過(guò)氧化氫生成水和生態(tài)氧,繼而形成分子氧消滅氣泡。試劑:3%過(guò)氧化氫溶液方法:取菌置于干凈的試管或玻片上,然后滴加3%過(guò)氧化氫數(shù)滴;或直接滴加3%過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培育基中,馬上觀看結(jié)果。結(jié)果:有大量氣泡產(chǎn)生為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡為陰性。應(yīng)用:革蘭陽(yáng)性球菌中,葡萄球菌和微球菌均陽(yáng)性。而鏈球菌均陰性。1l、硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn)原理:包括兩個(gè)過(guò)程:一是在合成過(guò)程中,硝酸鹽復(fù)原為亞哨酸鹽和氨。再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)菌內(nèi)其它含氮化合物。二是在分解代謝過(guò)程中,硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的受氫體,能使硝酸鹽復(fù)原的細(xì)菌從哨酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其它復(fù)原性產(chǎn)物。結(jié)果:消滅紅色為陽(yáng)性。假設(shè)參加試劑后無(wú)顏色變化反響,可能是①硝酸鹽沒(méi)有被復(fù)原,試驗(yàn)陰性。②硝酸鹽被復(fù)原為氨和氮等其它產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性,這時(shí)應(yīng)參加少許鋅粉,如消滅紅色則說(shuō)明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。假設(shè)仍不產(chǎn)生紅色,說(shuō)明為試驗(yàn)為假陰性。應(yīng)用:本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用廣泛。12、氧化酶(改進(jìn)法)試驗(yàn)試劑:四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)6.0g二甲基亞砜(DMSO)100.oml溶解TMPD于DMSO中,置于避光玻塞瓶中,可在室溫中保存幾個(gè)星期。方法:被檢菌株移種于 7%羊血瓊脂上,30℃需氧條件下孵育15~18h,刮取菌落涂布于無(wú)色濾紙片上,加l滴上述試劑,陽(yáng)性者在2min內(nèi)呈深藍(lán)色。假設(shè)被測(cè)菌株移種在蛋白胨酵母浸出液瓊脂上,至少孵育3天以上,5~10min13、CAMP原理:B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子,可促進(jìn)葡萄球菌的β-溶血素溶解紅細(xì)胞活性,因此在兩菌的交界處溶血力增加。消滅矢形(半月形)的溶血區(qū)。結(jié)果:在兩劃線交界處消滅箭頭樣的溶血區(qū)為陽(yáng)性應(yīng)用:在鏈球菌中,只有B群鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性。14、O/129原理:O/129(二氨基喋啶)對(duì)弧菌屬、鄰單胞菌屬細(xì)菌有抑制作用,而對(duì)氣單胞菌無(wú)抑制作用。方法:將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上,鑷取O/129紙片(含藥40ug)貼于平板上,35℃,18~24h,觀看結(jié)果。結(jié)果:消滅抑菌環(huán)為敏感,無(wú)抑菌環(huán)為耐藥應(yīng)用:弧菌屬、鄰單胞菌屬對(duì)O/129敏感,而氣單胞菌屬耐藥15、桿菌肽試驗(yàn)原理:A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全部敏感,而其它鏈球菌絕大多數(shù)對(duì)其耐藥。16、奧普托欣試驗(yàn)原理:幾乎全部的肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感,而Optochin對(duì)其它鏈球菌則無(wú)抑制作用17、.H2S原理:有些細(xì)菌能分解培育基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)產(chǎn)生硫化氫,硫化氫遇到鉛或亞鐵離子,則生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。結(jié)果:培育基變黑為陽(yáng)性,不變?yōu)殛幮?。?yīng)用:主要用于腸桿菌科屬或種的鑒定。18、觸酶試驗(yàn)(過(guò)氧化氫酶試驗(yàn))試劑:3%H202溶液,置棕色瓶?jī)?nèi)于4℃陰暗處保存。方法:先挑取固體培育基上的菌落,置于干凈的玻片上,然后滴加3%過(guò)氧化氫溶液1~2滴。靜置之,lmin內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡的為陽(yáng)性,不產(chǎn)生氣泡的為陰性。19、葡萄球菌凝固酶和分散因子試驗(yàn)葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝固酶試驗(yàn)稱為葡萄球菌凝固酶,玻片法為檢測(cè)分散因子。分散因子試驗(yàn):取1滴蒸餾水于干凈的玻片上,用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于蒸餾水中,制成濃的菌懸液,無(wú)自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)家兔血漿混合,10s內(nèi)觀看結(jié)果,消滅明顯細(xì)菌凝塊為陽(yáng)性,否則為陰性。如超過(guò)10s可消滅假陽(yáng)性,有10%~15%金黃色葡萄球菌呈假陰性,因此必需用試管法驗(yàn)證分散因子試驗(yàn)。操作過(guò)程中的留意點(diǎn):10s必需制備深厚的均勻菌懸液。(3)用EDTA(4)加血漿后不要再混攪,以免細(xì)菌凝塊分散變小。(5)生長(zhǎng)在高鹽培育基上的菌落可消滅自凝或假陽(yáng)性。葡萄球菌凝固酶試驗(yàn):用生理鹽水將血漿4倍稀釋,取0.5ml。然后挑取3~5個(gè)菌落于稀釋血漿中,成濃菌懸液。置37℃水浴,3~4h后讀取結(jié)果,凝固者為陽(yáng)性。假設(shè)陰性,連續(xù)觀看到24h,不凝固者為陰性。試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)作陽(yáng)性、陰性比照。試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者,應(yīng)見(jiàn)到明顯的纖維蛋白凝膠塊,消滅羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固,應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長(zhǎng)時(shí)間孵育,才可消滅陽(yáng)性。凝固酶試驗(yàn)應(yīng)考慮下述狀況:①某些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生溶纖維蛋白酶,溶解纖維蛋白凝塊。②所用血漿缺乏纖維蛋白原。③試驗(yàn)菌株不純。結(jié)果:玻片法以血漿中有明顯的顆粒消滅而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象判為陽(yáng)性;試管法以血漿凝固為陽(yáng)
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