食用菌制種技術

第三章食用菌制種技術教學目的與要求本章要求學生重點掌握菌種、制種的概念；掌握菌種的類型和制種的工藝流程；明確制種所需的設備和重點掌握食用菌一級、二級和三級菌種培養(yǎng)基的制備過程。要求學生重點分離中常用的組織分離法的操作過程；理解菌種的保存原理及常用保存方法。教學重點與難點1、掌握菌種、制種的概念2、掌握菌種的類型和制種的工藝流程3、重點掌握滅菌、消毒的概念和區(qū)別，高壓濕熱滅菌、常壓滅菌的方法；掌握常用的物理化學消毒方法4、重點掌握菌種的擴大方法和培養(yǎng)方法5、菌種分離中常用的組織分離法的操作過程第一節(jié)制種設備及程序基本器具有試管、菌種瓶、塑料袋、孢子收集器、天平、溫度計、濕度計、孢子收集器孢子收集器是用來采收菌類孢子的一種裝置，包括底盤、培養(yǎng)皿、三角架、紗布及有孔燈罩或鐘罩等。拌料設備主要有拌料機、鐵鏟等。裝料設備主要有裝料機、鐵鏟等。主要有滅菌鍋。滅菌鍋是一個可以密閉并能耐受一定壓力的金屬鍋。鍋底（或夾層）盛1．高壓蒸汽滅菌鍋，具有滅菌時間短，效果好，省燃料等優(yōu)點。缺點是投資前工廠生產的手提式、直立式、臥式等，也有用鋼板自制的。接種設備有接種箱、接種室、超凈工作臺、負離子發(fā)生器兩個小洞口，洞口裝有布袖套。箱的大小可自行決定，以方便操作為宜。接種箱結構簡單制造方便，成本低，且體積小，便于消毒徹底。接種室要求密閉、干燥，體積5m3—7m3為宜，外面應設有一間緩沖室，兩室的上方要求安裝紫外線滅菌燈及日光燈。風洞處打出，使工作臺范圍內成無菌狀態(tài)。負離子發(fā)生器是采用強電離對空氣進行滅菌的一種新方式。通過電離使用菌體蛋白質和核酸變性死亡，滅菌效果較理想。培養(yǎng)室是培養(yǎng)菌種的場所。室內裝有放置菌種的架子。要求干燥向陽，房間不宜過大，溫度均恒。常用的有棒形溫度計和干濕球溫度計。（一）菌種的概念和類型在自然界中，食用菌繁衍后代依靠孢子，孢子借風力傳播到適宜的環(huán)境下，萌發(fā)成菌），或子實體組織細胞經培養(yǎng)萌發(fā)形成的純菌絲體作為播種材料。制種是食用菌生產最重要的環(huán)節(jié)。菌種的優(yōu)劣，直接影響到食用菌的產量和質量。優(yōu)良菌種包含兩大方面的含義：一是指菌種本身的生物學特性，如高產、優(yōu)質、抗逆人工培養(yǎng)的菌種，根據菌種培養(yǎng)的不同階段，可分為母種、原是菌種類型的原始種。原始母種通過移接(轉管)成數(shù)支試管(斜面)種，這些移接的試管種，亦可稱為母種。把母種接到木屑、谷粒、棉子殼、糞草等瓶(袋)裝培養(yǎng)基上培養(yǎng)而成的菌種→原種培養(yǎng)→栽培種培養(yǎng)的程序（工藝流程）進行。第二節(jié)菌種培養(yǎng)基的制作培養(yǎng)基是用人工方法配合各種營養(yǎng)物質，供給食用菌生長繁殖的營養(yǎng)基質。培養(yǎng)基必須具備三個條件：第一，有食用菌生長所需的物質，如水分和養(yǎng)分，這些物質要有合適的比一定的氧化還原電位；第三，必須經嚴格滅菌，保持無菌狀態(tài)。由于食用菌菌種培育通常采用三級生產，即母鐘培育、原種培育和栽培種培育，所以和生產菌種相應用的培養(yǎng)基也可分為三種類型。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基。是通用的食用菌母種培養(yǎng)基。其組成是：馬鈴薯200克、瓊脂20按配方組成配制分裝于試管里、管口塞棉塞。及時滅菌，滅菌時間不能太長，一般以可供擴接母種使用。耳、香菇、猴頭。頭、金針菇、雞腿菇。菇，草菇，雞腿菇，姬松茸。各種培養(yǎng)料應是無霉爛、新鮮、干燥。各種培養(yǎng)基的含水量應肩為宜。然后用錐形木棒在瓶的中央向下插一個小洞，塞上棉塞。裝好的料瓶（袋）要當天滅菌，以免培養(yǎng)料發(fā)霉變質。第三節(jié)滅菌與消毒各種微生物都由蛋白質組成，加熱滅菌可以使蛋白質凝固從而達到殺死微生物的加熱滅菌經濟有效，簡便易行，可分為干熱滅菌和濕熱滅菌兩種。1、火焰滅菌是直接利用火焰反微生物殺死的方法，它中適用于金屬制的工具，玻璃器2、干熱滅菌是利用熱空氣進行滅菌的方法。滅菌溫度140℃—160℃,時間2—3h，它只適用于金屬及玻璃器皿的滅菌。電熱干燥箱是干熱滅菌常用的設備。1、高壓蒸汽滅菌利用高溫高壓蒸汽滅菌，是一種最有效、使用最廣泛的滅菌方法。蒸汽壓力與溫度成正比。高壓滅菌所采用的蒸汽壓力與時間，應根據具體物質而定。高壓滅菌鍋的形成與規(guī)格較多，有立式、臥式、手提式，能源用電、蒸汽、煤等。使用高壓蒸汽滅菌鍋應注意以下幾點：滅菌時升壓和降壓要緩慢；④滅菌過程應注意保持棉塞干燥。三、消毒要低溫消毒，加熱到60℃維持30min，即可殺死食品中的病原菌及多數(shù)細菌營養(yǎng)體。蘑菇培養(yǎng)料的后發(fā)酵，就是采用巴氏消毒法，殺死有害于蘑菇的病蟲雜菌。2、沸水消毒法主要用于針筒等器材的消毒，將有關的器材置沸水中燒煮一定時間，3、化學藥劑消毒法這是利用化學藥劑進行殺菌的方法。殺菌劑的種類及使用濃度：錯誤!未找到引用源。氧化劑：常用的氧化劑有高錳酸鉀、過氧化氫、漂白粉、漂白精等，常用的高錳酸鉀溶液濃度是0.1%，氯氣自來水清潔劑濃度為1ppm，漂白精濃度為5、滲透壓消毒利用高滲透壓殺菌或抑菌的方法稱滲透壓消毒。在高滲溶液中，微生物細胞由于脫水，質壁分離，不能正常進行新陳代謝而死亡，鹽水蘑菇就是利用這一原理制第五節(jié)菌種的分離、培養(yǎng)（一）組織分離法菇形圓整、無病蟲害菇作分離材料。菌柄中部縱切一刀，然后撕開，挑取菌蓋與菌柄交界處的一小塊組織，接種到PDA培養(yǎng)基上，數(shù)天后就可看到組織塊及培養(yǎng)基上有白色菌絲，即表明分離成功。2、菌核組織分離茯苓、豬苓、雷丸等藥用菌，常利用菌核分離得到菌種。分離方法色菌絲長出且無污染，即表明分離成功。（二）孢子分離法孢子分離法是利用菌類的成熟孢子能自動彈射的原理，在無菌操作條件下，使孢子在適宜的培養(yǎng)基上萌發(fā)長成菌絲體而獲得菌種。錯誤!未找到引用源。鉤懸法：將新鮮的成熟度適當?shù)亩脽o菌水沖洗后懸掛在無菌的三角瓶內或有孔鐘罩內，在一定溫度下讓其彈射孢子。木耳、銀耳常用此法采收孢子。耳木（菇木）分離法是利用耳木或菇木中的菌絲體得到菌種的方法。熟度適當、無雜菌感染的耳木或菇木進行分離。2、分離方法在所選耳棒長有子實體的部位，橫斷面鋸下鋸成1cm厚薄的木片，帶入放適宜溫度下培養(yǎng)。（四）土中菌絲分離法它是利用菌類地下的菌絲體來分離得到菌種的一種方法。主要用于腐殖質腐生菌的分離時要用無菌水反復沖洗菌絲束，把附著的泥土等雜物沖洗干凈，把無菌棉花或紗布吸干水養(yǎng)，無雜菌污染即分離成功。錯誤!未找到引用源。菌絲的鑒定。在土中獲得的菌絲，其可靠性較小，必須經過出菇鑒定，才能確認是該菌的菌種。進行培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3天后，菌絲開始生長時，要每天定期檢查，如發(fā)現(xiàn)黃、綠、橘紅、黑光直射，但也不要完全黑暗；注意通風換氣，室內保持清潔，空氣相對濕度不要超過65%;同時菌種瓶、袋不要堆疊過高，瓶間要有空隙，以防溫度過高造成菌絲衰老，生活力降低。特別是對加溫的培養(yǎng)室要注意：一要保持室內溫度的穩(wěn)定，因在溫差較大的情況(特別是母種培養(yǎng))會形成冷凝水，而使菌絲倒伏變黃。有條件的話，可根據菇類的菌絲生長對溫度的藏、冷凍真空及液氮超低溫等。550C下即易死亡，因此草菇菌種應保藏在lo~4—5'C的低溫下保藏，以后每隔2～3一般生產上，草菇多采用室內常溫保藏。低溫保藏菌種的培養(yǎng)基一般用營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基，如馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基等。為防止菌種在保藏過程中產生酸過多，在配制保藏用培養(yǎng)基時需添加少許緩沖鹽，如磷酸二氫鉀(KHP04)或碳酸鈣等。2斜面低溫保藏菌種雖然簡便，但保藏時間較短，需經常轉管，故容易發(fā)生退化現(xiàn)象。為了彌補這一缺點，在生產上，最好把斜面低溫保藏法與其他保藏法結合起來，以減少轉管次數(shù)。母種在第一次轉管時，盡量多移斜面試管，部分用第一次生產，取幾管作礦油保藏(或低溫保存的菌種用完后(或超過儲存期后)，再從第一代礦油保存的菌種移出殖。這樣做能使每批生產使用的菌種都保持在前幾代的水平上，有利于菌種優(yōu)良性狀的保持(圖3—1)。移接，室溫下可保藏6～8個月。用此法保藏的菌種不必置于冰箱內，室內比冰箱內保藏效壓蒸汽滅菌2～3次(每次30min)，然后經無菌檢查合格后方可使用。由于高壓蒸汽滅菌常有水蒸氣滲入，需在4'C溫箱或烘箱中烘烤8～10h，使水分蒸發(fā)。用無菌吸管將滅菌石蠟加入要保藏菌種斜面試管內，用量要高出斜面尖端約lcm。將棉塞齊口剪平，再用蠟密封管使用礦油保藏菌種時，不必倒去礦油，用接種工具從斜面上取一小塊菌絲先在無菌水此法是將食用菌孢子保藏于干燥的無菌沙土中，保藏期為2一10年。具體方法如下：1．取河沙過篩(60～80目篩子)，除去大沙粒，用10％的鹽酸浸泡以除去有機物。鹽種后抽干困難。3．把干沙、土按比例混合壓裝于安瓿管或小試管，裝入量以0.5～lcm為宜，加棉塞，高壓蒸汽滅菌(壓力在0．15MPa)滅菌3次查合格后(取少許干沙土放入牛肉湯培養(yǎng)液中，無菌生長)方可使用。4．用接種環(huán)將孢子接于沙土管中拌勻即可?；驅㈡哂诮佑?mL無菌水的試管中，充分播勻成孢于懸液，然后用lmL無菌吸管吸取孢子懸液加入沙土管中(每管加0.2mL)5．將接種后的沙土管置于盛有干燥劑(生石灰、氯化鈣或硅膠)的容器內，接上0．5KW的真空泵抽氣約8h，使沙土基本干燥。此法是采用真空、干燥和低溫三種手段來保藏菌種，因此菌種保藏期長達10～20年后仍不降低其原有性能。冷凍干燥保藏的基本方法是將需要保藏的孢子懸液裝在特制的安瓿管中，然后驟然冰凍，并立即抽成真空，使培養(yǎng)物以固體形態(tài)升華脫水，試驗證明，用此法保藏蘑菇、香菇、側耳和金針菇等食用菌的孢子和銀耳的芽孢子3年，全部存活，直至8年后仍有90％存活?？梢姷朔ú荒苡脕肀２夭婚L孢子的菌類。（一）液體超低沮保藏法試驗證明，用一130～一196℃液體氮超低溫冰箱能保藏所有食用茵菌種，包括一些不能用冷凍干燥保藏的菌種，甚至“怕冷”的草菇以10％甘油和510％二甲基砜做保護劑，居然也能在超低溫冰箱中保藏。由于超低溫能使代謝水平降到最低限度，因此菌種基在啟用液氮超低溫保藏的菌種時，應先將安瓿管置于35～40℃的溫水中，使管中的冰塊迅速溶解，然后再啟安瓿管，取懸浮的菌絲塊移植在培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。（二）菌絲球生理鹽水法先將食用菌菌種用液體振蕩培養(yǎng)3～7天，然后將形成的菌絲球吸入裝有5mL無菌生（三）麥粒菌種保藏法麥粒菌種保藏法是