分光光度計基本原理與結(jié)構(gòu)分析課件

分光光度計基本原理、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用介紹

吳偉華1分光光度計基本原理、結(jié)構(gòu)、應(yīng)用介紹吳偉華1許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。實踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度，對溶液中所含的物質(zhì)進行定量分析。基于比較顏色深淺對溶液進行定量分析的方法稱為比色分析法。22溶液為什么會有顏色，顏色又為什么與濃度有關(guān)呢？下面就討論這個問題。一、光的互補及有色物質(zhì)的顯色原理1．光的波粒二象性光是能的一種表現(xiàn)形式，是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播，在不同的介質(zhì)處發(fā)生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現(xiàn)象。可用波長、頻率、傳播速度等參量來描述，即光具有“波動性”。光的顏色即由光的波長決定，人眼能感覺到的光稱為可見光，其波長在400～750nrn之間。在可見光之外是紅外光和紫外光。3溶液為什么會有顏色，顏色又為什么與濃度有關(guān)呢？下面就討論這個同時，光也具有“粒子性”，光電效應(yīng)就是一個很好的例子。光的粒子性理論認為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。在輻射能量時，光是以一份一份的能量E的形式輻射的，同時光被吸收時，能量也是一份一份被吸收的。這每一份能量的大小為hυ。光子的能量與波長的關(guān)系為E=hυ=hc／λ式中E為光子的能量（J：焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(shù)（6.63×10-34J?S），c為光速，λ為光的波長4同時，光也具有“粒子性”，光電效應(yīng)就是一個很好的例子。光的粒因此，不同波長的光，其能量不同，短波能量大，長波能量小。2。光的顯色原理若把某兩種顏色的光，按一定的強度比例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補色。圖4－1中處于直線關(guān)系的兩種光為互補色。如綠光和紫光為互補色，黃光和藍光為互補色等等。各種溶液會呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì)點（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實驗證明：溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收光的互補色。如一束白光通過高錳酸鉀溶液時，綠光大部分被選擇吸收，其它的光透過溶液。從互補色示意圖可以看出，透過光中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。5因此，不同波長的光，其能量不同，短波能量大，長波能量小。566二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結(jié)合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計也符合這個定律。溶液對光的吸收當一束強度為I的平行單色光照到溶液時，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光則透過溶液，如圖4-2所示7二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律788有：I0=Ia+Ir+ItI0--入射光強度Ia--吸收光強度Ir--反射光強度It--透射光強度通常由于Ir很小可忽略不計，上式可簡化為I0=Ia+It透射光It與入射光強度I0之比為透光率或透光度，用T表示：T=It/Ia透光率的負對數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示：A=－lgT=lg1/T=lgIa/It9有：I0=Ia+Ir+It9吸光度越大，表示該物質(zhì)對光的吸收越強。透光度和吸光度都是用來表示入射光被吸收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。實驗證明，單色光經(jīng)過有色溶液時，透過溶液的光強度不僅與溶液的濃度有關(guān)，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對光的吸收性能有關(guān)。其規(guī)律可用下式表示為A＝KCL式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶液的消光（吸收）系數(shù)；C——溶液的濃度；L——光程，即溶液的厚度。10吸光度越大，表示該物質(zhì)對光的吸收越強。透光度和吸光度都是用來消光系數(shù)K是一個常數(shù)。一種有色溶液對于一定波長（單色光）的入射光的K值具有一定的數(shù)值。若溶液的濃度以摩爾／升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時的K值稱為摩爾消光系數(shù)。摩爾消光系數(shù)是有色化合物的重要特性之一，根據(jù)這個數(shù)值的大小，可以估計顯色反應(yīng)的靈敏程度。從上式可以看出，當K和L不變時，光密度E與溶液濃度C成正比關(guān)系，也可以說，當一束單色入射光經(jīng)過有色溶液且入射光、消光系數(shù)和溶液厚度不變時，吸光度A是隨著溶液濃度而變化的。11消光系數(shù)K是一個常數(shù)。一種有色溶液對于一定波長（單色光）的這種單色光與有色溶液的關(guān)系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計和分光光度計的比色分析方法就是根據(jù)這一定律來進行的。但是，朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。三、朗伯-比爾定律的應(yīng)用1．等吸光度法從朗伯-比耳定律可知，當用同一光源照射同一物質(zhì)的不同濃度溶液時，若吸光度相等，則兩溶液各自的濃度和透光液層厚度的乘積也相等。利用此關(guān)系在可見光區(qū)用眼作檢測器（目視比色法），即可求出待測溶液的濃度。12這種單色光與有色溶液的關(guān)系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計和分2．計算法根據(jù)被測溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標準溶液。用同樣的方法處理標準溶液與被測溶液，使其成色后，在同樣的實驗條件下用同一臺儀器分別測定它們的吸光度。在標準溶液中：As=KsCsLs在待測溶液中：Ax=KxCxLx如果測定時選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長的單色光，保持溫度相同，則K也相等。將兩式相除可得As/Ax=Cs/Cx132．計算法13由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設(shè)計一種儀器，可以測量吸光度A值，則待測溶液的濃度即可求出Cx=Ax/As?Cs由于儀器的性能和實驗環(huán)境在不斷的變化，所以在采用計算法時，必須每次都要對標準液和被測液進行測量，然后利用上式進行計算，否則會帶來較大的測量誤差。由于一般光電比色計在結(jié)構(gòu)上有不少偏離朗伯一比耳定律的地方，故欲得到較準確的結(jié)果，常采用標準曲線法。14由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設(shè)計一3．標準曲線法這種方法分以下幾步：（1）先配制五種以上標準濃度的溶液。（2）測出每種溶液的吸光度A。（3）做A～C標準曲線圖，如圖4－3所示。有了標準工作曲線便可對溶液進行測量。在同樣的條件下，用儀器測出A后，查標準曲線即可得被測溶液的濃度值Cx。153．標準曲線法151616171718181919核酸的定量分光光度計顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm，蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。20核酸的定量分光光度計顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。21蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈比色法蛋白質(zhì)定量Lowry法：以最早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。22比色法蛋白質(zhì)定量Lowry法：以最早期的Biuret反應(yīng)為基細菌細胞密度（OD600）

實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài)。23細菌細胞密度（OD600）23主要技術(shù)指標1.樣品量：0.5-5ul2.靈敏度dsDNA：2-20000ng/ul3.單機版操作:內(nèi)置軟件4.操作方式:彩色觸屏和按鍵，可外接鼠標鍵盤5.測試協(xié)議：核酸，蛋白，菌液，細胞裂解物，UV-VIS6.數(shù)據(jù)輸出形式：數(shù)據(jù)圖表輸出，通過U盤，CSV格式文件，數(shù)據(jù)&圖表輸出或112mm寬打印紙輸出，7