功能基因篩選的基本策略

功能基因篩選的基本策略

目前,國內(nèi)外進(jìn)行功能基因篩選研究的基本策略包括:(1)通過表達(dá)譜差異分析、生物信息學(xué)分析和基因克隆等途徑獲得候選基因;(2)對候選基因進(jìn)行功能評價(identificationoffunction,可在基因組

、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組和代謝產(chǎn)物等水平進(jìn)行);(3)基因功能確證(validationoffunction);(4)決定開發(fā)戰(zhàn)略。

1.1差異表達(dá)篩選功能基因

獲得候選基因的研究路線之一是通過正常和疾病組織的表達(dá)譜差異分析(expressionprofilingofnormalanddiseasedtissues)獲得疾病的相關(guān)基因,進(jìn)一步進(jìn)行基因功能的篩選研究(圖1)。該篩選策略與疾病過程密切相關(guān),較多地應(yīng)用于新藥及治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[1～3]。

1.2

生物信息學(xué)

分析

確定候選功能基因獲得候選基因的另一研究路線是通過生物信息學(xué)

分析(bioinformaticanalysis)預(yù)測、選定基因序列、克隆獲得候選基因,進(jìn)一步進(jìn)行基因功能的篩選研究(圖2)[4]。該研究策略篩選范圍廣,多用于新基因的功能探索研究。

用于生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)資料,主要來源于DNA

芯片技術(shù)和其他相關(guān)技術(shù)測定的基因表達(dá)信息[4]。通過與已知基因或蛋白質(zhì)序列的分析、比較,可以確定候選研究基因序列長度,提供該未知基因產(chǎn)物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白類型和細(xì)胞定位等預(yù)測信息[5]。然而,由于人類基因組中約1/3的基因序列與其他基因無同源性,因此這些基因的功能不易進(jìn)行直接預(yù)測。另一方面,蛋白質(zhì)的功能表現(xiàn)還與其所處的分子環(huán)境有關(guān),一種蛋白質(zhì)實(shí)際上與相鄰蛋白質(zhì)形成了功能網(wǎng)絡(luò)(functionalnetworks)。

因此,生物信息學(xué)中的功能網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析,對于了解復(fù)雜信號通路及與其他基因產(chǎn)物的關(guān)系,可能會提供有價值的參考信息[6]。

1.3其他

除上述研究策略外,其他途徑的功能基因研究也在進(jìn)行,如直接從正?；蚣膊〗M織中克隆單一未知基因,進(jìn)行功能研究。

2、表達(dá)譜分析法

表達(dá)譜差異分析(differentialexpressionprofiling)主要包括基因表達(dá)譜(geneexpressionprofiling)和蛋白質(zhì)表達(dá)譜(proteinexpressionprofiling)[3,4,7]。大規(guī)模表達(dá)譜分析已經(jīng)成為認(rèn)識疾病分子機(jī)制的有利方法,在癌癥研究等方面取得了一定的進(jìn)展[2～4]。成功的表達(dá)譜分析基于實(shí)驗(yàn)及其過程分析的有機(jī)結(jié)合。實(shí)驗(yàn)過程從關(guān)注的疾病開始,首先收集大量的疾病相關(guān)組織樣本,樣本數(shù)量可從10多個到數(shù)百個,但必須足以對每一組織類型及個體差異進(jìn)行比較分析,而且許多情況下不能僅簡單地分為正常和疾病組織。例如,在對糖尿病的研究中,所收集的樣本來自健康人、胰島素耐受和糖尿病病人的不同試驗(yàn)階段,如胰島素治療前后。樣品還應(yīng)包括其他器官的取材,以便進(jìn)行基因表達(dá)的組織分布研究。為了便于對后來的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析管理,需采集并儲存所有的組織樣本和臨床參數(shù)。接下來進(jìn)行組織樣本的處理,利用生物芯片(寡核苷酸芯片、cDNA芯片或全基因組芯片)進(jìn)行表達(dá)譜測定,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

通常,表達(dá)譜的分析結(jié)果需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。定量RT2PCR

是最靈敏的確證方法,該方法還可以將確證實(shí)驗(yàn)的范圍擴(kuò)大到原測組織以外的更廣泛的組織和組織類型,揭示基因表達(dá)的組織分布情況。

確證實(shí)驗(yàn)揭示了疾病相關(guān)基因。據(jù)此,可以進(jìn)行進(jìn)一步研究,探索這些基因的功能,開發(fā)新的治療手段。例如,對于正常和疾病組織中表達(dá)有顯著性變化的基因,可以進(jìn)行新治療靶點(diǎn)的鑒定和確定研究,或利用實(shí)驗(yàn)和分析工具研究分析其功能;對于疾病組織中活性升高的酶,可以當(dāng)作前藥活化酶進(jìn)行鑒定研究。典型的表達(dá)譜能夠顯示疾病過程中有大量的已知基因表達(dá)的改變,而許多已知基因的代謝通路、表達(dá)產(chǎn)物酶學(xué)分類和蛋白質(zhì)功能業(yè)已發(fā)表,將兩者對照分析,可以鑒定出酶活性,選擇其中可能成為前藥活化酶的部分進(jìn)行進(jìn)一步研究;對于疾病特異的蛋白質(zhì),可以進(jìn)行抗原表型分析,決定疫苗的開發(fā)策略[1]。

尋找差異表達(dá)基因的方法除芯片技術(shù)外,一些新的檢測方法如差異顯示PCR(di