實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理和應(yīng)用課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理和應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理和應(yīng)用1目錄? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理PCR熒光標(biāo)記絕對定量和相對定量? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)展digitalPCR,qPCR

Array目錄? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理PCR2實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase

chain

reaction

(PCR)1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性41985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase

chain

reaction

(PCR)1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了5PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈結(jié)合引物子鏈延長PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC6PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈結(jié)合引物子鏈延長GGAUCG

5‘5‘

AUCGCG3’3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC7PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5‘3’DNA解旋解鏈結(jié)合引物子鏈延長TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCG5‘AUCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC8PCR原理1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA單鏈與引物復(fù)性DNA雙螺旋DNA2變性形成條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR原理1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）9模板DNA第一輪擴(kuò)增第二輪擴(kuò)增第三輪擴(kuò)增第四輪擴(kuò)增第五輪擴(kuò)增模板DNA第一輪擴(kuò)增第三輪擴(kuò)增第四輪擴(kuò)增第五輪擴(kuò)增10實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光11實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個

循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)熒光定量P12熒光PCR特點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)全封閉PCR過程，無需后處理即時(shí)反映擴(kuò)增過程，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，更適用于定量定量范圍寬，可達(dá)到10個數(shù)量級，無須稀釋樣品可實(shí)現(xiàn)一管多檢儀器自動分析，更快獲得結(jié)果熒光PCR特點(diǎn)靈敏度高13實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理14實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。C(t)

value實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理Ct值的定義：C(t)value15Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的16實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-定量原理?理想的PCR反應(yīng)：?X=X0*2n?非理想的PCR反應(yīng)：?X=X0

(1+Ex)n? n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)? X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量? X0：初始模板量? Ex：擴(kuò)增效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-定量原理?理想的PCR反應(yīng)：?X=X17實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0

(1+Ex)Ct

=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對數(shù)得:lgM=lgX0

(1+Ex)Ct整理方程式(2)得:(2)lg

X0=

-

Ct×

lg(1+Ex)

+

lg

M (3)Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XC18實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-定量原理

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。40393837363534333231302928272625242322212019181716151101001000

10000Copy

Numbers100000100000010000000C(t)

ValueStandard

Curve實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-定量原理 模板DNA量越多，熒光19實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-相對定量XCt=X0(1+Ex)Ct,x=KxRCt=R0(1+ER)Ct,R

=KRXCtRCt

R0(1+ER)Ct,RX0(1+Ex)Ct,xK=

x

=

KKR=X0R0×

(1+E)Ct,x-Ct,R=

KXN

×

(1+E)

Ct

=

KXN= RX00Ex=ER=E:XN

=

K×(1+E)

-CtXN,q

=

K×(1+E)

-Ct,qK×(1+E)

-Ct,cb

=XN,cb(1+E)

-

Ct

Ct=

Ct,q-

Ct,cb樣本q的XN除以校準(zhǔn)樣本（Calibrator）cb的XN：靶核酸：參比內(nèi)標(biāo)：Ct=Ct,x-Ct,R：實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-相對定量XCt=X0(1+Ex)Ct20實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-相對定量Livak&

Schmittgen,

Method,2001,25:402-408實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-相對定量Livak&Schmit21絕對定量和相對定量? 絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA，RNA）– 病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)– 轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)? 相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含量– 差異表達(dá)分析– 芯片評估– 轉(zhuǎn)基因生物的檢測– 基因型檢測絕對定量和相對定量? 絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度22熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記：1、

SYBRGreen

Ⅰ2、EvaGreen3、LC Green特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、AmplisensorRQ Q熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記：3、MolecularBeaco23SYBR

GREEN

ISYBRGreenⅠ 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen

SYBRGreen

Ⅰ 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光

變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光

復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreenⅠ發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號（一般設(shè)置在復(fù)性階段）。SYBRGREENISYBRGreenⅠ 能結(jié)合到雙鏈24SYBR

GREEN

熔解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGREEN熔解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)25SYBR

GREEN

熔解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，有雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物SYBRGREEN熔解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非26SYBR

GREEN法優(yōu)缺點(diǎn)

對DNA模板沒有選擇性----適用于任何DNA

使用方便-----不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針

非常靈敏

便宜優(yōu) 點(diǎn) 缺 點(diǎn)

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分

析，優(yōu)化反應(yīng)條件

對引物特異性要求較高SYBRGREEN法優(yōu)缺點(diǎn)對DNA模板沒有選擇性優(yōu) 點(diǎn)27FRET當(dāng)某個熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實(shí)際相當(dāng)于將短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。FRET當(dāng)某個熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重28Taq

man探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,

R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)

(Quencher,

Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收

，無熒光，

R與Q分開，發(fā)熒光（熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，F(xiàn)RET）

Taq酶有

5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)29Taq

man

探針?

特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶

5’→3’外切酶活性Taqman探針?特異性熒光雙標(biāo)記探針30Taq

man

探針法優(yōu)缺點(diǎn)

對目標(biāo)序列的高特異性------陰性結(jié)果確定

設(shè)計(jì)相對簡單------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)

點(diǎn)

只適合一個特定的目標(biāo)

委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高

不易找到本底低的探針缺

點(diǎn)Taqman探針法優(yōu)缺點(diǎn) 對目標(biāo)序列的高特異性優(yōu)點(diǎn)31Molecular

Beacon

分子信標(biāo)環(huán)標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成莖熒光素 淬滅劑MolecularBeacon分子信標(biāo)環(huán)環(huán)與目標(biāo)序列互32Molecular

Beacon

分子信標(biāo)MolecularBeacon分子信標(biāo)33Molecular

Beacon

分子信標(biāo)高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)

點(diǎn) 缺

點(diǎn)

只能用于一個特定目標(biāo)

設(shè)計(jì)困難

價(jià)格比較高M(jìn)olecularBeacon分子信標(biāo)高特異性：對目標(biāo)34高分辨率熔解曲線High

resolution

melting

cure(HRM)Reed

et

al.

Pharmacogenomics

(2007)

8(6),

597–608高分辨率熔解曲線Reedetal.Pharmacoge35實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用36實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用基因擴(kuò)增擴(kuò)增特異性分析基因定量分析基因檢測基因分型SNP分析RFLP多態(tài)性分析單/多基因表達(dá)研究高通量基因表達(dá)譜研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用基因擴(kuò)增37疾病的早期診斷?

免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長達(dá)70天，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。?

病原體檢測：確定病原體的種類和基因型，以利于治療方案的確定疾病的早期診斷?免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床38遺傳疾病的早期診斷? 熒光PCR可實(shí)現(xiàn)對點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測，對產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。遺傳疾病的早期診斷? 熒光PCR可實(shí)現(xiàn)對點(diǎn)突變、缺失突變、插39藥物研究?

任何一種抗病毒藥物，以免疫標(biāo)志物來評價(jià)其療效均不夠敏感和及時(shí)，若以病毒復(fù)制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動態(tài)變化來評價(jià)療效，則較為直接和理想。?

新藥篩選：藥物作用靶標(biāo)的研究，基因表達(dá)的變化?

藥效的評價(jià)：對服藥后體內(nèi)基因表達(dá)或病原體載量的變化進(jìn)行監(jiān)控，更好的評價(jià)藥效，有助于治療方案的改進(jìn)藥物研究?任何一種抗病毒藥物，以免疫標(biāo)志物來評價(jià)其療