DNS法測定還原糖的含量

DNS法測定還原糖的含量

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3，5-二硝基水楊酸溶液與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范實(shí)驗(yàn)圍內(nèi)反應(yīng)的還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系，可測定生成化合物的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線反推出還原糖的濃度。操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少，適于生物制氫中還原糖含量的測定。實(shí)驗(yàn)原理2精選課件pptChemistry

顯色條件包括:波長選擇，顯色劑用量，顯色時間，溶液酸度，顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。此次實(shí)驗(yàn)選擇波長選擇，顯色劑用量，顯色時間，溶液酸度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3精選課件ppt一．試劑的配置DNS試劑：稱量18.1992g酒石酸鉀鈉溶于50ml蒸餾水中，加熱，趁熱加入0.6313g3，5-二硝基水楊酸（DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上述溶液中，稱量0.5128g苯酚和0.5064g無水亞硫酸鈉移入配置好的溶液中，蒸餾水定容至100ml，該試劑避光保存7～10天。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0*10-2mol/l）：準(zhǔn)確稱量0.1990g無水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述10-2mol/l溶液，稀釋至100ml容量瓶中。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述10-3mol/l溶液，稀釋至100ml容量瓶中。4精選課件ppt試管號01234DNS/ml02221水/ml31糖/ml001（10-3mol/l）

1（10-4mol/l）2（10-2mol/l)二.顯色條件的選擇

1.波長選擇取5支試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴15min,均加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，在不同波長處分別進(jìn)行掃描。5精選課件ppt圖1為不同條件下溶液的波長——吸光度圖（水調(diào)零）。由圖1可以看出白色與綠色曲線幾乎重合，說明0.0001mol/l葡萄糖溶液與DNS反應(yīng)生成的氨基化合物極少，用比色法很難區(qū)分，故此法所能夠測量的葡萄糖濃度應(yīng)大于0.0001mol/l。由DNS＋H2O曲線可以看出當(dāng)波長大于530nm時，DNS的吸光度已經(jīng)很小，這時DNS對反應(yīng)生成的氨基化合物吸光度的影響可以忽略。

6精選課件pptFig.24號試管稀釋10倍后波長掃描吸光度A

λ/nm圖2為4號試管稀釋10倍后波長掃描圖4號試管用高濃度的葡萄糖溶液和少量的DNS試劑反應(yīng)，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，儀器無法測定，故將其稀釋10倍。以水調(diào)零未出現(xiàn)最高峰，以DNS調(diào)零時（圖2）在540nm處有最高峰，這說明在該濃度下，DNS可能會對氨基化合物吸光度的測量有較大影響，故測量時以DNS調(diào)零較準(zhǔn)確。選擇540nm作為最佳吸收波長。7精選課件ppt2.DNS用量選擇取試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴30min,加入適量水使定容為10ml，流水冷卻，以1號試管中DNS溶液為參比，在540nm處測吸光度。

試管號01234567DNS/ml0211.522.533.5水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖001111118精選課件ppt

由圖3可以看出溶液的吸光度隨著DNS用量的增大而增大，但當(dāng)DNS用量達(dá)到3.5ml時，吸光度反而下降，這說明DNS的用量不是越多越好，只要在與糖的反應(yīng)中DNS有剩余即可。如果DNS用量過多，會使測量時DNS溶液濃度過大，造成測量不準(zhǔn)。綜合考慮，此次實(shí)驗(yàn)選定的DNS用量為2ml。

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3.反應(yīng)時間(水浴時間)取試管按下表加相應(yīng)溶液，沸水浴相應(yīng)時間后,加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，以6號試管中的DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。

試管號0123456789DNS/ml0222222222水/ml3

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11*10-4mol/l糖/ml0111110111煮沸時間/min155101520251530405010精選課件ppt

由圖4可以看出，隨著煮沸時間的加長，吸光度加大，另有實(shí)驗(yàn)表明單純加熱DNS試劑也會使其吸光度增大，故在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定未知濃度時，煮沸時間必須相同。此次實(shí)驗(yàn)確定最佳煮沸時間為30min。11精選課件ppt4反應(yīng)溶液的酸度范圍的選擇取試管按下表加相應(yīng)試劑，由于所用器皿為試管，不方便用PH計(jì)調(diào)節(jié)PH，此次實(shí)驗(yàn)采用加入不同量的6%的鹽酸溶液的辦法，以PH試紙調(diào)節(jié)溶液的酸度。煮沸20min后，各加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。試管號01234567DNS/ml02222222水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111PH/〉141189107〉1412精選課件ppt圖5中的PH是用PH試紙調(diào)出的，該曲線只能反映變化趨勢。由圖5可以看出，溶液的堿性越強(qiáng)，反應(yīng)進(jìn)行的越完全，溶液的酸度越小，越有利于氨基化合物的生成。另外由于DNS試劑就是用NaOH溶液配制的，單純DNS與水的混合液的PH值已經(jīng)超過14。且DNS在反應(yīng)中是過量的，反應(yīng)時間是足夠長的，故測量時只需將被測溶液調(diào)至中性，無需刻意調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物溶液的PH值，保證測量時DNS試劑、糖的用量與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時相同即可。13精選課件ppt三．標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取試管按下表加相應(yīng)試劑，由0.01mol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制x*10-4mol/l（3<=x<=27）的葡萄糖，煮沸30min后，各加入7ml水定容為10ml，流水冷卻，以DNS試劑調(diào)零，在540nm處測吸光度。試管號01234567891011121314DNS/ml022222222222222水/ml31

葡萄糖/ml001111111111111濃度/10-4mol/l

357911131517192123252714精選課件ppt下圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，葡萄糖含量（mol/l）與相應(yīng)的吸光度（A）有一定的線性關(guān)系，且其回歸方程為：y=-0.14971+0.035786x，R=0.9954。15精選課件ppt另外采用較高濃度的葡萄糖來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到下圖2：其回歸方程為：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.當(dāng)所測得的吸光度比較小時，可用圖1中的方程，當(dāng)所測得的吸光