分離分析法導(dǎo)論

分離分析法導(dǎo)論第1頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月一、色譜分析法及其基本概念1、色譜法的發(fā)展1906年，俄植物學(xué)家M.Tswett分離植物色素植物葉的色素組成葉綠素a（藍(lán)綠色）葉綠素b（黃綠色）胡蘿卜素（橙色）葉黃素（黃色）第2頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月DevelopingofChromatographicTechnique1948,8daysseparationfor16aminoacids第4頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月DevelopingofChromatographicTechnique1958,22hoursseparationfor19ofaminoacids第5頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月DevelopingofChromatographicTechnique1982,lessthan30minutesseparationfor18ofaminoacids第6頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2、色譜法分類（1）按流動相和固定相所處狀態(tài)分氣相色譜（GC）氣液色譜（固定相為固定液，即固定相是附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體）氣固色譜（固定相是固體吸附劑）液相色譜（LC）液液色譜液固色譜（2）按固定相的固定方式分柱色譜（固定相裝于柱內(nèi)的色譜法）紙色譜（固定相是濾紙上的水分，呈平板狀）薄層色譜（固定相是吸附劑粉末制成的薄層，呈平板狀）第7頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）按分離原理分吸附色譜（利用組分在固定相上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法）分配色譜（利用組分在（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法）離子交換色譜（利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法）排阻色譜（利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，又稱凝膠色譜法）第8頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月3、色譜圖及常用術(shù)語（1）色譜圖：試樣各組分經(jīng)色譜分離后，從柱后流出進(jìn)入檢測器，檢測器將各組分濃度（或質(zhì)量）的變化轉(zhuǎn)換為電信號（電壓或電流），再由記錄儀記錄下來，所得的電信號強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線，即為流出曲線，也稱為色譜圖，曲線上突起部分就是色譜峰。第9頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）常用術(shù)語①基線：柱中只有流動相流過時(shí)，檢測器的響應(yīng)信號記錄值，穩(wěn)定的直線應(yīng)是一條水平直線。②峰高h(yuǎn)：色譜峰頂點(diǎn)與基線的垂直距離峰寬：峰底寬Y

半峰寬：1/2h處的峰寬，Y1/2

標(biāo)準(zhǔn)偏差：0.607h處的峰寬為2

峰面積：第10頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月③保留值：表示試樣中各組分在色譜柱內(nèi)停留狀況的指標(biāo)，反映組分分子與固定相分子間作用力的大小，通常用時(shí)間和流動相的體積表示。用體積表示的保留值（單位：mL）死體積（V0）：不被固定相保留的組分，通過色譜柱所消耗的流動相體積，由死時(shí)間確定保留體積（VR）：試樣從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所通過的流動相體積調(diào)整保留體積（VR’）：VR’=VR-V0用時(shí)間表示的保留值（單位：min，s等）死時(shí)間（t0）：不被固定相保留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需的時(shí)間，也即流動相流經(jīng)色譜柱所需的時(shí)間保留時(shí)間（tR）：試樣從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰所需的時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間（tR’）：tR’=tR-t0相對保留值（2,1）：也稱選擇性因子，為兩組分的調(diào)整保留值之比一般選擇tR2’大于tR1’，所以值大于1，越大，分離效果越好。第11頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜峰的個(gè)數(shù)——判斷組分的個(gè)數(shù)色譜峰的保留值——定性分析色譜峰的面積或峰高——定量分析相對保留值——固定相與流動相的選擇是否合適保留值、區(qū)域?qū)挾取u價(jià)色譜柱分離效能的好壞色譜圖

信息第12頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）分配平衡樣品組分在固定相與流動相之間進(jìn)行多次分配使其得到分離。第13頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品在固定相與流動相之間進(jìn)行分配，很快達(dá)到平衡，即分配平衡。當(dāng)流動相流過時(shí)，樣品將在流動相和新的固定相中又達(dá)到分配平衡，同時(shí)原來仍在固定相中的樣品與新的流動相之間也會形成新的分配平衡，隨著流動相的不斷流過，它們攜帶發(fā)生分配平衡后仍存在于流動相中的樣品沿著柱子向前流動，從而達(dá)到不同組分分離的目的。色譜分離原理及分離參數(shù)分配系數(shù)（組分在固定相中的濃度）（組分在流動相中的濃度）分配比（組分在固定相中物質(zhì)的量）（組分在流動相中物質(zhì)的量）第14頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月分配比影響因素：組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)；溫度和壓力等因素；流動相及固定相的體積。分配系數(shù)影響因素：組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)；溫度和壓力等因素。（組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此分配比又稱分配容量或容量因子）第15頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月A,B組分未分離A,B組分分離不完全A,B組分分離完全二、色譜分析法基本理論兩組分的分配系數(shù)有差異區(qū)域擴(kuò)散速率小于區(qū)域分離速率受哪些因素影響？塔板理論速率理論第16頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月1、塔板理論結(jié)論：n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系n大于50，可得到峰形基本對稱的曲線只要被分離組分K有差異，只要n足夠大，經(jīng)過反復(fù)多次的分配后均可進(jìn)行分離假設(shè)：（1）色譜由一系列連續(xù)的，相等的水平塔板組成，每一塔板高度為H，理論塔板數(shù)n=L/H（2）在每一塔板內(nèi)，組分可在兩相間迅速達(dá)到平衡（3）流動相進(jìn)入是間歇的，而非連續(xù)，每次進(jìn)入為一個(gè)塔板體積（4）所有組分開始存在于0號塔板上，而且試樣沿縱向擴(kuò)散不計(jì)（5）分配系數(shù)K恒定不變第17頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月理論優(yōu)點(diǎn)：解釋了流出曲線的形狀，提出了計(jì)算和評價(jià)柱效能高低的因素（n

）如果若tR一定，那么n越大，H越小，則色譜峰越窄，柱效能越高。理論缺點(diǎn)：（1）色譜過縱向擴(kuò)散等不能忽略，（2）塔板理論只能定性地給出板高的概念，不能解釋板高受哪些因素影響，無法提出降低塔板高度的方法（3）不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)（4）分配系數(shù)與濃度無關(guān)只能在有限的濃度范圍內(nèi)成立（5）色譜柱中沒有真正的平衡體系第18頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2、速率理論1956年，荷蘭，范弟姆特，速率理論A：渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)，B：分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)，C：傳質(zhì)項(xiàng)系數(shù)，u：平均流速A，B，C越小，H越小，n越大，柱效高A，B，C越大，H越大，n越小，柱效低第19頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月A-渦流擴(kuò)散項(xiàng)由于流動相流經(jīng)填充物的不規(guī)則空隙時(shí)，其流動方向改變，形成紊亂的類似“渦流”的流動而引起渦流擴(kuò)散過程示意圖影響因素：：填充不規(guī)則因子；dp：填充物平均直徑結(jié)論

dp越?。ú捎眯☆w粒填充物），越小（顆粒均勻），A就越小，空心毛細(xì)管柱A＝0第20頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月B/u-分子擴(kuò)散項(xiàng)（縱向擴(kuò)散項(xiàng)）樣品在縱向上的濃度梯度而造成的擴(kuò)散（a）柱內(nèi)組分?jǐn)U散（b）相應(yīng)的響應(yīng)信號影響因素：：彎曲因子。填充柱中由于固定相顆粒的存在，使分子自由擴(kuò)散受到阻礙，擴(kuò)散程度降低，<1；空心毛細(xì)管柱=1。

Dg：組分分子在其氣相中的擴(kuò)散系數(shù)。組分分子量大，柱溫高，柱壓大，載氣分子量大，Dg小；反之則大。

u：流動相平均線速，縱向擴(kuò)散與組分在色譜柱內(nèi)停留時(shí)間有關(guān)，流動相流速小，組分停留時(shí)間長，縱向擴(kuò)散就大。結(jié)論：采用分子量較大的載氣，較高的載氣流速，控制較低的溫度，可使分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)減小第22頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月Cū-傳質(zhì)阻力項(xiàng)物質(zhì)遷移過程中存在的阻力第24頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月Cm：流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)，即為待測試樣組分從流動相移動到固定相表面的進(jìn)行分配時(shí)所受到的阻力影響因素：容量因子k’

，填充物平均直徑dp，組分在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)Dg

結(jié)論：采用顆粒小的填充物，及分子量小的載氣Cs：固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)，組分分子由流動相進(jìn)入固定相內(nèi)部，達(dá)到分配平衡，又回到界面，再溢出界面，被流動相帶走這一過程受到的阻力影響因素：容量因子k’

，固定液液膜厚度df

，組分在固定相中的擴(kuò)散系數(shù)Ds

結(jié)論：降低液膜厚度第25頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月范氏方程總的影響因素：填充物的均勻程度，填充物粒度的大小，流動相的種類和線速，固定相的液膜厚度第26頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月柱效：色譜分離的動力學(xué)因素，由理論塔板數(shù)來衡量。如果若tR一定，那么n越大，H越小，則色譜峰越窄，柱效能越高。選擇性：兩峰間的距離衡量色譜的選擇性，距離越大選擇性越好，一般以表示3、色譜分離效能的衡量(a)兩組分沒有完全分離(b)兩組分完全分離，但柱效不高(c)兩組分分離不完全，但柱效較好(d)兩組分分離完全，且柱效很好第27頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月分離度分離度概念：又叫分辨率或分辨度，色譜峰中相鄰兩峰分離程度的量度，是相鄰兩峰保留值之差與兩峰峰底寬的平均值之比。R值越大，表明相鄰兩組分分離越好Rs<1，兩峰部分重疊Rs=1，兩峰剛好分離(分離程度可達(dá)98%)Rs>1.5，兩峰完全分離(分離程度可達(dá)99.7%)分離度基本方程式：第28頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

n越大，R越大——n=L/H，(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

增加柱長的色譜柱可以提高分離度，但延長了分析時(shí)間。制備一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高分離度。（1）分離度與柱效的關(guān)系（3）分離度與相對保留值的關(guān)系

r2,1=1時(shí)，R=0，不能使兩組分分離。r2,1>1才可進(jìn)行分離。r2,1大，選擇性好。r2,1的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。改變固定相和流動相的性質(zhì)、組成或降低柱溫，可有效增大r2,1值。

k增大可使R增大，當(dāng)k>10時(shí)，k/k＋1改變不大，R增長是不大，一般取k為1~10最宜。改變柱溫和相比，可以改變k。（2）分離度與分配比的關(guān)系第29頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月已知物質(zhì)A和B在一根30.00cm長的柱上的保留時(shí)間分別為16.40min和17.63min。不被保留組分通過該柱的時(shí)間為1.30min。峰底寬度分別為1.11min和1.21min，計(jì)算：（1）柱的分離度；（2）柱的平均塔板數(shù)；（3）達(dá)到1.5分離度所需的柱長度。解：（1）柱的分離度

R=2（17.63-16.40）/（1.11+1.21）=1.06

（2）柱的平均塔板數(shù)

n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2

=3397n平均

=（3493+3397）/2=3445

（3）達(dá)到1.5分離度所需的柱長度

R1/R2=(n1/n2)1/2

n2=3445(1.5/1.06)2=6898L=nH=6898(300/3445)=60cm第30頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、色譜的定性分析和定量分析與標(biāo)樣對照的方法保留值法（單柱法和雙柱法）相對保留值法已知物的峰高加入法1、色譜定性方法利用保留指數(shù)法定性方法：分別測出待測物質(zhì)i與基準(zhǔn)物質(zhì)s的調(diào)整保留值，求出相對保留值ris，將ris與文獻(xiàn)值比較后定性?；鶞?zhǔn)物質(zhì)通常選容易得到純品的，且與被分析組分相近的物質(zhì)，如正?。ㄎ欤┩椤h(huán)己烷（醇、酮）、苯、對二甲苯等。

優(yōu)點(diǎn)：ris僅隨固定液及柱溫變化，與其它操作條件無關(guān)。方法：首先作出未知物樣品的色譜圖，然后在未知物樣品中加入某已知物，又得一色譜圖，峰高增加的組分即可能為這種組分。優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)未知樣品中組分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易辨認(rèn)時(shí)，或僅作未知樣品指定項(xiàng)目分析時(shí)均可用此法。第31頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

例：確定物質(zhì)i在某固定液X上的保留指數(shù)IiX

的數(shù)值。tR(Z+1)

內(nèi)插法求IiX示意圖信號

tR(Z)

tR(i)

t進(jìn)樣保留指數(shù)定性法（柯瓦指數(shù)）方法步驟：（1）規(guī)定正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為其碳原子數(shù)乘以100，如正戊烷，正己烷、正庚烷的保留值分別為500，600和700（2）z，z+1為正構(gòu)烷烴的碳數(shù)，測得碳數(shù)為z，z+1以及樣品i的調(diào)整保留時(shí)間分別為tR(z)’，tR(z+1)’，tR(i)’，且tR(z)’<tR(i)’<tR(z+1)’，求Ix

’。（3）由求出的Ix

’值查閱文獻(xiàn)，推測未知物。優(yōu)點(diǎn)：保留指數(shù)計(jì)算準(zhǔn)確，準(zhǔn)確度高，值僅與柱溫和固定相有關(guān)第32頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月利用質(zhì)譜定性試樣試樣

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCD氣相色譜質(zhì)譜分離鑒定BACD第33頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理：質(zhì)譜分析是將樣品轉(zhuǎn)化為運(yùn)動的帶電氣態(tài)離子碎片，于磁場中按質(zhì)荷比(m/z)大小分離并記錄的分析方法。分子離子碎片離子重排裂解碰撞裂解第34頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月2、色譜定量分析定量分析基礎(chǔ)：待測組分的質(zhì)量或濃度與色譜峰的峰面積或峰高成正比定量分析步驟：準(zhǔn)確測量檢測器的響應(yīng)信號—峰面積或峰高；峰高乘以半峰寬法A=1.065hY1/2

峰高乘以平均峰寬法A=1/2h(Y0.15+Y0.85)

剪紙稱重法自動積分法準(zhǔn)確求得比例常數(shù)—校正因子；正確選擇合適的定量計(jì)算方法，將測得的峰面積或峰高換算為組分的百分含量。第36頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）校正因子絕對校正因子相對校正因子：組分i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對校正因子之比。fi

值由文獻(xiàn)中得，