野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)組分析

野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)組分析1975年，意大利生化學(xué)家O'Farell建立了經(jīng)典的2-DE技術(shù)，并首次成功用于分離約1000個大腸桿菌、老鼠及幾尼豬的蛋白質(zhì)斑點，但蛋白質(zhì)譜不穩(wěn)定，易隨環(huán)境而變化[61]。經(jīng)過近40年的發(fā)展，伴隨著如固相pH

梯度凝膠電泳,

差異凝膠電泳,

質(zhì)譜技術(shù)等的建立與完善，2-DE技術(shù)已日趨成熟，是目前唯一可以在一塊凝膠上同時分離上萬個蛋白質(zhì)的方法，且分離純度可達90%以上。2007年，Wang

等[62]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從分子水平考察復(fù)方雙丹（丹參和丹皮）煎劑抗大鼠急性心肌梗死的作用機制，運用2-DE和MALDI-TOFMS結(jié)合技術(shù)分離和鑒定了23個差異蛋白，這些蛋白分別與能量代謝、氧化應(yīng)激和細胞骨架有關(guān)，從而整體闡述了雙丹煎劑通過調(diào)節(jié)心肌能量代謝、抗氧化應(yīng)激損傷等多途徑發(fā)揮抗心肌梗死的作用。Qi[63]等運用蛋白質(zhì)組學(xué)研究桃紅四物湯對氧糖剝奪腦缺血再灌注損傷PC12細胞凋亡的保護機制，采用2-DE結(jié)合MALDI-TOFMS

分析了26個與桃紅四物湯調(diào)控作用相關(guān)的蛋白質(zhì)，并鑒定這些蛋白參與多種重要的生化過程，具有不同的生理功能。本研究應(yīng)用雙向電泳技術(shù)對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座的蛋白質(zhì)組進行分析，篩選出野生冬蟲夏草及人工冬蟲夏草差異性蛋白質(zhì)，驗證前期冬蟲夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)并在蛋白質(zhì)層面揭示了野生冬蟲夏草與人工培育冬蟲夏草的差異，為鑒別野生、人工冬蟲夏草提供資料。1儀器與材料1.1儀器低溫高速離心機：貝克曼X-22R型雙向電泳系統(tǒng)：Bio-Rad公司凝膠掃描成像系統(tǒng)：

Bio-Rad公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海島韓實業(yè)公司DHG-9035A型1.2試劑聚丙烯酰胺預(yù)混液、甘氨酸、BSA（純度≥99%）、Tris堿、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、過硫酸銨、覆蓋瓊脂糖、QuickStart?Bradford1x

DyeReagent、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、IPG膠條(17cm,pH3-10)、Bio-Lyte

(pH3-10)、DTT、PrecisionPlusProtein?

預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品、礦物油均購自Bio-Rad公司；PMS、APS、考馬斯亮藍R-250、低熔點瓊脂糖、溴酚藍、-巰基乙醇、Tween-80、購自鵬程生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、TCA、丙酮、甲醇、冰乙酸購自成都科龍化工試劑廠，均為分析純；水為去離子水。1.3主要試劑配置PBS緩沖液(0.02mol/L，pH=7.2)：5.16gNa2HPO4，0.87gNaH2PO4，超純水溶解定容至100mL。蛋白質(zhì)提取液：PBS緩沖液(0.02mol/L，pH=7.2)，0.2%Tween80，0.2%β-巰基乙醇，1mMPMSF。10%TCA-丙酮：20gTCA，0.14gDTT，加丙酮溶解，定容至200mL，-20℃預(yù)冷。10%SDS：10gSDS，少量超純水加熱溶解，定容至100mL，混勻，室溫保存。10%APS：0.1gAPS，用時加入1mL超純水溶解，4℃保存。10×電泳緩沖液(10×=25mMTris,192mM

甘氨酸，0.1%SDS,pH8.3)：30gTris堿，144g甘氨酸，10gSDS，適量超純水溶解，定容至1000mL，混勻后室溫保存。膠條平衡緩沖液母液：72g尿素，4gSDS，適量超純水溶解，加入50mL

Tris-HCl(1.5MpH8.8Tris-HCl)，20mL甘油，定容至100mL。分裝，-20℃保存。水化上樣緩沖液：4.2g尿素，1.52g硫脲，0.4gCHAPS，0.098gDTT，適量超純水溶解，加入50L40%Bio-Lyte，10L溴酚藍(1%)，超純水定容至10mL。分裝，-20℃保存。膠條平衡緩沖液I：0.2gDTT，10mL膠條平衡緩沖液母液，充分混勻，用時現(xiàn)配。膠條平衡緩沖液II：0.2g碘乙酰胺，10mL膠條平衡緩沖液母液，充分混勻，用時現(xiàn)配。1.4藥材野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草樣品2017年采自四川省阿壩州小金縣經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國錦琳教授鑒定為小金縣野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草，留樣標(biāo)本存放于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室。2方法2.1蛋白質(zhì)提取2.1.1蛋白質(zhì)的提取取樣品粉末約0.2g，加入液氮適量，加入0.02mol?L-1PBS

緩沖液(pH7.2)

5mL(1%PMSF)，充分研磨至糊狀，4℃浸提過夜。取出離心，4℃，13000rpm，30min，重復(fù)離心，收集上清液。2.1.2蛋白質(zhì)的保存將2.1.1得到的上清液用Bradford法[27]測定其含量，用0.22微米的膜除菌，無菌分裝于0.5mLEP中，進行標(biāo)記，置4oC保存?zhèn)溆谩?.2蛋白質(zhì)含量測定2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備配制BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg?mL-1)，按下表制作蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，用紫外分光光度計檢測OD595并記錄。表7.Bradford法蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備Table7.Preparationofastandardcurveforproteinquantification圖23

Bradford法測定冬蟲夏草蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure.23StandardcurveofOphiocordycepssinensisproteincontentdeterminedbyBradfordmethod2.2.2樣品含量測定取2.1.1項下蛋白粗提液50uL，采用2.2.1項進行蛋白質(zhì)含量測定。2.3蛋白質(zhì)純化（TCA-丙酮沉淀蛋白[28]）取2.1.1項下蛋白粗提取液，加入10倍體積TCA-丙酮(10%TCA,0.07%DTT)，漩渦混合后于-20℃靜置1h，離心，10min，13000rpm，棄去上清液；加入-20℃預(yù)冷丙酮洗滌4次，室溫自然干燥后水化上樣緩沖液溶解，低溫震搖1h，離心取上清液，再次離心，取上清液保存?zhèn)溆谩?.4雙向電泳凝膠[28][29]采用2.3.1項蛋白質(zhì)樣品，上樣量為600ug。第一向不搭鹽橋的方式進行水化，設(shè)置水化溫度20℃，被動水化12~16h。第二向SDS參照郭堯君[30]方法，凝膠濃度12%T，電泳過程起始采用低電流10mA/gel，一小時后改變電流為30mA/gel，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。2.5染色電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍法（0.1%考馬斯亮藍R250，45%甲醇，10%冰乙酸）染色，過夜，脫色液（10%甲醇，10%冰乙酸）搖床脫色至背景脫色干凈。2.6凝膠掃描及圖像分析用ImagescanerII透射掃描儀對凝膠進行掃描，分辨率為150dpi，保存圖像。使用PDQUESTTMBasic(Bio-Rad)和SPSS進行圖像和數(shù)據(jù)的處理分析。3結(jié)果3.1蛋白質(zhì)含量分析表8

不同來源冬蟲夏草蛋白質(zhì)含量(n=3)Table8.ProteincontentofOphiocordycepssinensisfromdifferentsources(n=3)P>0.053.3冬蟲夏草共有斑點驗證課題組前期得到冬蟲夏草共有蛋白質(zhì)88個[29]，本研究利用PDQUET軟件對該88個蛋白質(zhì)點進行驗證樣。驗證得到：野生冬蟲夏草整體中存在共有蛋白質(zhì)70個，野生冬蟲夏草子座中存在共有蛋白質(zhì)60個，野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體存在共有蛋白質(zhì)67個；人工蟲草整體中存在共有蛋白質(zhì)59個，人工蟲草子座中存在共有蛋白質(zhì)53個，人工蟲草菌蟲復(fù)合體存在共有蛋白質(zhì)54個。如圖24-30。圖24.課題組前期鑒定88個冬蟲夏草共有蛋白Figure24.Thestudygroupidentified88commonproteinsofOphiocordycepssinensisinearlystage圖25.野生冬蟲夏草驗證得到70個共有蛋白質(zhì)Figure25.WildOphiocordycepssinensishasbeenverifiedtohave70proteins圖26.野生冬蟲夏草子座驗證得到60個共有蛋白質(zhì)Figure26.WildOphiocordycepssinensisstromahasbeenverifiedtohave60proteins圖27.野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體驗證得到67個共有蛋白質(zhì)Figure27.MycoticcomplexofwildOphiocordycepssinensishasbeenverifiedtohave67proteins圖28.人工蟲草驗證得到59個共有蛋白質(zhì)Figure28.ArtificialOphiocordycepssinensishasbeenverifiedtohave59proteins3.4冬蟲夏草及偽品差異斑點驗證利用PDQUET軟件對冬蟲夏草與偽品的電泳圖譜對比分析，對課題組前期實驗得到的26個冬蟲夏草正偽品指標(biāo)性蛋白進行驗證。實驗發(fā)現(xiàn)，野生冬蟲夏草蛋白斑點550個，人工冬蟲夏草蛋白斑點364個，相同樣本蛋白圖譜匹配率為57%~89%，驗證得到：野生冬蟲夏草23個正偽品差異蛋白，子座19個正偽品差異斑點，菌蟲復(fù)合體22個正偽品差異斑點；人工冬蟲夏草20個正偽品差異斑點，子座14個正偽品差異斑點，菌蟲復(fù)合體18個正偽品差異斑點。見圖31-37。圖31.前期課題組鑒定正偽品26個差異蛋白Figure31.Earlyidentificationof26authenticityproductsinthestudygroup圖32.野生冬蟲夏草驗證得到23個差異蛋白Figure32.Verificationof23differentialproteinsbywildOphiocordycepssinensis圖33.野生冬蟲夏草子座驗證得到19個差異蛋白Figure33.Verificationof19differentialproteinsbystromaofOphiocordycepssinensis圖34.野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體驗證得到22個差異蛋白Figure34.Verificationof22differentialproteinsbymycoticcomplexofwildOphiocordycepssinensis圖35.人工冬蟲夏草驗證得到20個差異蛋白

Figure35.Verificationof20differentialproteinsbyartificialOphiocordycepssinensis3.5差異蛋白斑點軟件分析3.5.1人工冬蟲夏草與野生冬蟲夏草差異蛋白分析利用PDQUESTTMBasic軟件對冬蟲夏草圖譜進行匹配分析后，建立冬蟲夏草共有蛋白凝膠作為參照膠，分別對人工蟲草圖譜為分析膠進行組間匹配，進行差異表達分析經(jīng)過分析后得到感光度sensity=3.0的差異表達蛋白點。結(jié)果顯示，在野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草的對比分析中，僅存在野生冬蟲夏草中的差異表達蛋白25個，如圖38；僅存在于人工冬蟲夏草中的差異表達蛋白2個，表達量明顯差異的蛋白3個，如圖39。這些差異蛋白多分布在15kD~30kD的范圍內(nèi)，多為酸性蛋白。圖38.野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草差異表達蛋白Figure38.ProteinsdifferentiallyexpressedbetweenwildOphiocordycepssinensisandartificialOphiocordycepssinensis圖39.僅在人工冬蟲夏草中存在的蛋白及含量明顯減少的蛋白Figure39.ProteinsfoundinartificialOphiocordycepssinensisonlyandproteinswithsignificantlyreducedlevels3.5.2人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體與野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體差異蛋白分析利用PDQUESTTMBasic軟件對冬蟲夏草蟲體圖譜進行匹配分析后，建立冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體共有蛋白凝膠作為參照膠，對人工蟲草菌蟲復(fù)合體部分圖譜為分析膠進行組間匹配，進行差異表達分析經(jīng)過分析后得到感光度sensity=3.0的差異表達蛋白點。結(jié)果顯示，在野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體與人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體部分的對比分析中，僅存在于野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體中的差異表達的蛋白30個，如圖40；僅存在于人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體部分的差異蛋白4個，如圖41。這些差異蛋白多分布在30kD~75kD的范圍內(nèi)，多為中性及堿性蛋白。圖41.僅在人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體中存在的蛋白Figure41.ProteinsfoundonlyinthemycoticcomplexofartificialOphiocordycepssinensis圖40.僅在野生冬蟲夏草蟲體中存在的蛋白Figure40.ProteinsfoundonlyinwildOphiocordycepssinensis3.5.3人工冬蟲夏草子座與野生冬蟲夏草子座差異蛋白分析利用PDQUESTTMBasic軟件對冬蟲夏草子座圖譜進行匹配分析后，建立冬蟲夏草子座共有蛋白凝膠作為參照膠，對人工蟲草子座圖譜為分析膠進行組間匹配，進行差異表達分析經(jīng)過分析后得到感光度sensity=3.0的差異表達蛋白點。結(jié)果顯示，在野生冬蟲夏草子座與人工冬蟲夏草子座部分的對比分析中，僅存在于野生冬蟲夏草子座中的差異表達蛋白22個，如圖42；僅存在于人工冬蟲夏草子座部分的差異表達蛋白4個，如圖43。圖譜顯示，這些差異蛋白多分布在25kD~50kD的范圍內(nèi)，多為酸性蛋白。圖42.僅在野生冬蟲夏草子座中存在的蛋白

Figure42.ProteinsfoundonlyinwildOphiocordycepssinensis圖43.僅在人工冬蟲夏草子座中存在的蛋白Figure43.ProteinsfoundonlyinartificialOphiocordycepssinensis4小結(jié)本部分研究通過2-DE技術(shù)，獲得了野生冬蟲夏草、人工冬蟲夏草及其菌蟲

復(fù)合體、子座的蛋白質(zhì)表達圖譜。圖譜分析發(fā)現(xiàn)野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)均具有良好的多樣性，蛋白質(zhì)種類豐富；野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草蛋白質(zhì)斑點分布模式相似，表明蛋白質(zhì)在冬蟲夏草種內(nèi)表達穩(wěn)定。5討論5.1蛋白質(zhì)含量及斑點數(shù)分析本部分研究采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，分析發(fā)現(xiàn)野生冬蟲夏草及其菌蟲復(fù)合體、子座蛋白質(zhì)含量均高于人工冬蟲夏草，同時圖像對比分析發(fā)現(xiàn)，野生冬蟲夏草及其菌蟲復(fù)合體、子座蛋白質(zhì)斑點數(shù)量也遠高于人工冬蟲夏草。表明了環(huán)境對冬蟲夏草的生長發(fā)育具有正向的影響。同時也說明了人工冬蟲夏草樣品蛋白質(zhì)種類的多樣性不及野生冬蟲夏草樣品。5.2冬蟲夏草共有蛋白質(zhì)驗證前期課題組通過雙向電泳技術(shù)(2-DE)得到冬蟲夏草共有蛋白質(zhì)斑點88個[29]。本研究在此基礎(chǔ)上，對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座及人工冬蟲夏草整體、子座、菌蟲復(fù)合體進行2-DE分析，建立蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，使用PDQUEST對其進行圖像分析，驗證得到：野生冬蟲夏草中存在共有蛋白質(zhì)70個，野生冬蟲夏草子座中存在共有蛋白質(zhì)60個，野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體存在共有蛋白質(zhì)67

個；人工蟲草中存在共有蛋白質(zhì)59個，人工蟲草子座中存在共有蛋白質(zhì)53個，人工蟲草菌蟲復(fù)合體存在共有蛋白質(zhì)54個。野生冬蟲夏草樣品中共有斑點均多于人工樣品。5.3前期冬蟲夏草與混偽品差異斑點驗證前期課題組通過雙向電泳技術(shù)(2-DE)得到冬蟲夏草指標(biāo)性蛋白質(zhì)斑點26個[28]。本研究在前期課題組基礎(chǔ)上，對野生冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座及人工冬蟲夏草整體、菌蟲復(fù)合體、子座進行2-DE分析，建立蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，PDQUEST對其進行圖像分析，驗證得到野生冬蟲夏草23個指標(biāo)性蛋白質(zhì)、野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體22個指標(biāo)性蛋白質(zhì)、野生冬蟲夏草子座19個指標(biāo)性蛋白質(zhì)、人工冬蟲夏草20個指標(biāo)性蛋白質(zhì)、人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體18個指標(biāo)性蛋白質(zhì)、人工冬蟲夏草子座14個指標(biāo)性蛋白質(zhì)。野生冬蟲夏草各樣品中混偽品指標(biāo)性蛋白質(zhì)均多于人工冬蟲夏草。證實了實驗所用人工冬蟲夏草樣品與偽品具有明顯差異，并能夠從蛋白質(zhì)組層面分辨。5.42-DE圖像分析本部分試驗在前期方法的基礎(chǔ)上，獲得質(zhì)量較高的2-DE圖譜。2-DE圖譜分析結(jié)果顯示冬蟲夏草各樣品蛋白質(zhì)較豐富，在分子質(zhì)量10-90kDa范圍內(nèi)普遍分布，多樣性良好。5.4.1人工冬蟲夏草與野生冬蟲夏草差異蛋白分析蛋白質(zhì)含量上，野生冬蟲夏草樣品蛋白質(zhì)含量為0.65%，人工冬蟲夏草樣品為0.57%；蛋白質(zhì)種類上，兩種冬蟲夏草樣品均顯示出良好的多樣性，但圖譜顯示野生冬蟲夏草樣品蛋白質(zhì)斑點數(shù)為550，人工冬蟲夏草樣品為364，差異蛋白多分布在15kD-30kD的范圍內(nèi)，多為酸性蛋白。5.4.2人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體與野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體差異蛋白分析蛋白質(zhì)含量上，野生冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體樣品蛋白質(zhì)含量為0.78%，人工冬蟲夏草菌蟲復(fù)合體樣品為0.67%；蛋白質(zhì)種類上，兩種菌蟲復(fù)合體樣品均顯示出良好的多樣性，但圖譜顯示野生菌蟲復(fù)合體樣品蛋白質(zhì)斑點數(shù)為468，人工菌蟲復(fù)合體樣品為379，差異蛋白多分布在30kD-75kD的范圍內(nèi)，中性及堿性蛋白占多數(shù)。5.4.3人工冬蟲夏草子座與野生冬蟲夏草子座差異蛋白分析蛋白質(zhì)含量上，野生冬蟲夏草子座樣品蛋白質(zhì)含量為0.86%，人工冬蟲夏草樣品為0.54%；蛋白質(zhì)種類上，兩種冬蟲夏草子座樣品均顯示出良好的多樣性，但圖譜顯示野生子座樣品蛋白質(zhì)斑點數(shù)為535，人工冬蟲夏草樣品為300，差異蛋白多分布在25kD-50kD的范圍內(nèi)，多為酸性蛋白。綜上所述，野生冬蟲夏草及其菌蟲復(fù)合體、子座雖然與人工冬蟲夏草2-DE

圖譜相似，具有相似的蛋白質(zhì)成分表達，但各部分蛋白質(zhì)含量與蛋白斑點數(shù)均高于人工品，差異蛋白主要集中在15kD-75kD的范圍內(nèi)，且多為酸性蛋白。其中差異最大的是子座部分。蛋白質(zhì)含量上野生冬蟲夏草子座比人工冬蟲夏草子座高出約0.3%，蛋白質(zhì)種類上，野生冬蟲夏草子座比人工冬蟲夏草子座多出近200種蛋白質(zhì)。提示在冬蟲夏草菌侵染小金蝠蛾幼蟲的過程中，環(huán)境因子對冬蟲夏草內(nèi)在化學(xué)成分表達呈正向的影響揭示了蛋白質(zhì)層面。表明了野生冬蟲夏草蛋白質(zhì)含量更高，多樣性更豐富，遠優(yōu)于人工冬蟲夏草。全文結(jié)論本課題基于蛋白組與轉(zhuǎn)錄組，以揭示冬蟲夏草生長發(fā)育過程中遺傳、生理、生化等特征的變化為目的，進行了以下工作：1.

本實驗利用IlluminaHiSeq2500對人工培育冬蟲夏草子實體、菌絲體及小金蝠蛾幼蟲轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草菌絲體、子實體和冬蟲夏草具有高同源性，而小金蝠蛾幼蟲與其他樣品的同源性很低；發(fā)現(xiàn)4個sod-1基因MSTRG.2218，MSTRG.5467，MSTRG.5954和MSTRG.69514在子實體中的表達水平上調(diào)，表明這4個sod-1基因與子實體的發(fā)育相關(guān)；肌動蛋白基因MSTRG.3317的表達水平在冬蟲夏草中下調(diào)，微管蛋白相關(guān)基因MSTRG.3823，MSTRG.6894的表達水平均在子實體中上調(diào)，表明肌動蛋白和微管蛋白相關(guān)基因表達的改變可能在子實體發(fā)育中起作用。這些結(jié)果均與冬蟲夏草的生長發(fā)育相關(guān)。2.

通過2-DE對冬蟲夏草發(fā)育過程中的三個階段（菌蟲復(fù)合體、子座、整體體）及小金蝠蛾幼蟲的蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)在冬蟲夏草的生長過程中，小金蝠蛾幼蟲與人