核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座培訓(xùn)課件

內(nèi)容一、基本技術(shù)（一）核酸提取

1.基因組DNA提取

2.非基因組DNA提取

3.RNA提?。ǘ㏄CR擴(kuò)增

1.普通PCR

2.熒光定量PCR

(三)核酸、PCR產(chǎn)物的鑒定

1.瓊脂糖凝膠電泳

2.紫外分光光度法二、相關(guān)技術(shù)三、分子平臺(tái)使用流程及儀器設(shè)備操作規(guī)范1核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023（一）核酸提取提取DNA目的：

主要是對(duì)基因和基因組進(jìn)行分析。提取RNA目的：

主要是對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析。2核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023基因組DNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備破碎、裂解細(xì)胞核酸分離和純化沉淀或吸附核酸，去除雜質(zhì)核酸溶解在適量緩沖液或水中組織培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)菌外周血（一）基因組DNA提取

組織－－勻漿或液氮研磨

培養(yǎng)細(xì)胞－－蛋白酶K外周血--裂解液

細(xì)菌--裂解液氯仿或吸附柱異丙醇、吸附柱70％的乙醇洗滌蛋白質(zhì)的去除鹽離子的去除3核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20231、材料準(zhǔn)備基因組DNA來(lái)源：組織/培養(yǎng)的細(xì)胞/外周血最好使用新鮮樣本，低溫保存的樣品不要反復(fù)凍融提取外周血DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（單個(gè)核細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成核酸降解含病毒的標(biāo)本DNA含量較少，提取前先富集（一）基因組DNA提取4核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023取組織塊0.3-0.5cm3剪碎，加TE緩沖液0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。加20%

SDS25μl，蛋白酶K(2mg/ml)25μl，混勻。60℃水浴1-3h。蛋白酶K使多種蛋白質(zhì)水解，并且蛋白酶K可在SDS存在下有活性。a勻漿法TE緩沖液是弱堿性,對(duì)DNA的堿基有保護(hù)作用,不易破壞其完整性或產(chǎn)生開環(huán)及斷裂。SDS能使DNA和蛋白質(zhì)分開。b液氮研磨法

組織標(biāo)本的處理：

（一）基因組DNA提取

2、破碎裂解細(xì)胞5核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023液氮研磨組織注意事項(xiàng)確定起始樣品量，在研磨前稱量好。研磨過程中要及時(shí)添加液氮，邊研磨邊添加?？梢詫⒀欣彿旁诖笮『线m的泡沫盒里面研磨，這樣可以保溫，減小液氮揮發(fā)的速度。研磨成粉末，在液氮揮發(fā)盡，應(yīng)立即加入裂解溶液（裂解溶液一定要含有抗氧化劑，防止DNA被氧化降解。常用的抗氧化劑有PVP，β-巰基乙醇等）。裂解液加入后繼續(xù)研磨，直至標(biāo)本融化成液態(tài)。b液氮研磨法6核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023

培養(yǎng)細(xì)胞處理：將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用PBS洗滌一次。離心4000g，5min，去除上清液。加10倍體積的裂解緩沖液。50-55℃水浴1-2h。要散細(xì)吹胞團(tuán)塊，使細(xì)胞被充分裂（一）基因組DNA提取

破碎裂解細(xì)胞7核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023

外周血的處理紅細(xì)胞裂解法

將1mlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500rpm離心15min傾去含裂解紅細(xì)胞的上清。重復(fù)一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細(xì)胞沉淀，37℃水浴溫育1h。（一）基因組DNA提取

破碎裂解細(xì)胞8核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023分離單個(gè)核細(xì)胞

Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）

密度梯度離心法，因?yàn)檠褐懈饔行?/p>

成分的比重存在差異，因此得以分離。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同

時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％～95％，細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過25℃時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率。9核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023細(xì)菌的處理將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。沉淀中加入500μl的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30μl10%SDS和15μl的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h。（一）基因組DNA提取

破碎裂解細(xì)胞10核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023核酸分離、沉淀、洗滌和溶解暴露出的DNA（一）基因組DNA提取吸附材料或氯仿抽提吸附柱或異丙醇沉淀漂洗液或70%乙醇洗滌TE緩沖液或雙蒸水水溶解分離

洗滌沉淀溶解11核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023質(zhì)粒DNA的提取細(xì)菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體，提取后可用作構(gòu)建基因表達(dá)載體。

（二）非基因組DNA提取培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增

收集和裂解細(xì)菌

分離和純化質(zhì)粒DNA分離質(zhì)粒的三大步驟12核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023

材料準(zhǔn)備使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）質(zhì)粒DNA提?。ǘ┓腔蚪MDNA提取13核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023

當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將其分開

質(zhì)粒DNA提?。ǘ┓腔蚪MDNA提取裂解法原理：裂解細(xì)菌14核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023質(zhì)粒DNA堿裂解法流程對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解酒精沉淀質(zhì)粒DNA溶液質(zhì)粒DNA提?。ǘ┓腔蚪MDNA提取溶液1作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部，抑制DNase的活性，螯合二價(jià)金屬離子。溶液2：溶液2中的NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。溶液3：是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，15核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023暴露出的DNA吸附材料或氯仿抽提吸附柱或異丙醇沉淀漂洗液或70%乙醇洗滌TE緩沖液或去離子水溶解質(zhì)粒DNA純化質(zhì)粒DNA提?。ǘ┓腔蚪MDNA提取16核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023核酸純化時(shí)所需試劑蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌17核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023DNA提取常見問題DNA樣品不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子原因?qū)Σ咧匦录兓疍NA，去除蛋白等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）（一）DNA提取及鑒定18核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023DNA提取常見問題DNA降解原因材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染DNA反復(fù)凍融對(duì)策盡量取新鮮材料，液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融（一）DNA提取及鑒定19核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023RNA提取基本步驟破碎細(xì)胞或者組織抽提RNA沉淀、洗滌和晾干

溶解

（三）RNA提取及鑒定TRIZOL氯仿異丙醇、酒精同DNA提取處理無(wú)RNA酶水注意RNA酶的污染20核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023如何避免RNA酶的污染訂購(gòu)去RNA酶的一次性耗材在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行分裝使用后的槍頭盒進(jìn)行沖洗晾干21核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023培養(yǎng)細(xì)胞：通常可直接加TRIZOL裂解酵母和細(xì)菌：一般TRIZOL可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍外周血：直接加TRIZOL或提取單個(gè)核細(xì)胞后加入TRIZOL裂解（三）RNA提取及鑒定材料準(zhǔn)備22核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023TRIZOL可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。（三）RNA提取及鑒定裂解細(xì)胞23核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023影響RNA提取因素

標(biāo)本：標(biāo)本新鮮切忌反復(fù)凍融如果標(biāo)本來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘?biāo)本貯存在TRIZOL或樣品貯存液中，于－80℃保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份于－80℃保存樣品量：保證充分裂解，樣品和裂解液比例適當(dāng)（100mg組織樣本加1ml裂解液，細(xì)胞數(shù)1×106加1ml裂解液）DNA污染：為了減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量（三）RNA提取及鑒定24核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023RNA提取常見問題RNA的降解OD260/OD280比值偏低RNA效率低（二）RNA提取及鑒定25核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023正常RNA瓊脂糖凝膠電泳圖RNA降解的瓊脂糖凝膠電泳圖26核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023避免RNA降解的方法新鮮細(xì)胞或組織：組織取出后馬上進(jìn)行提取或冷凍提取的RNA沉淀短期保存于-20℃，-80℃長(zhǎng)期保存如果用胰酶消化細(xì)胞要充分洗去胰酶，以免影響后續(xù)操作溶液或離心管要去除RNase，將一次性耗材進(jìn)行分裝使用，必要時(shí)進(jìn)行高溫高壓。冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至

-80℃冰箱保存。先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。27核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023紫外吸收法

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質(zhì)，其吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。核酸的摩爾消光系數(shù)（或稱吸收系數(shù)）用來(lái)表示（即A值）測(cè)得未知濃度核酸溶液的A260值，即可以計(jì)算出其中DNA或RNA的含量。該操作方法簡(jiǎn)便，迅速，樣品用量少。DNA濃度（ug/ml）＝A260/0.020/L×稀釋倍數(shù)RNA濃度（ug/ml）＝A260/0.024/L×稀釋倍數(shù)

28核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023OD260/OD280比值偏低

檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA的吸收峰在OD260時(shí)最高，低離子濃度和低pH條件下，OD280值會(huì)較高

OD260/OD280比值偏低的原因有樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少水相中混有有機(jī)相：苯酚殘留最后得到的RNA沉淀未完全溶解29核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023獲得RNA效率低

樣品裂解或勻漿處理不徹底不同細(xì)胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。最后得到的RNA沉淀未完全溶解30核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023核酸測(cè)定1、溴乙錠熒光法2、紫外吸收法31核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023溴乙錠熒光法(電泳)原理：熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液（Marker)作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可相對(duì)比較出被測(cè)DNA溶液濃度。32核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023紫外吸收法

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質(zhì)，其吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。核酸的摩爾消光系數(shù)（或稱吸收系數(shù)）用來(lái)表示為每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）測(cè)得未知濃度核酸溶液的A260值，即可以計(jì)算出其中DNA或RNA的含量。該操作方法簡(jiǎn)便，迅速，樣品用量少。DNA濃度（ug/ml）＝A260/0.020/L×稀釋倍數(shù)RNA濃度（ug/ml）＝A260/0.024/L×稀釋倍數(shù)

33核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023核酸的保存：

DNA保存近期常用的4℃保存短期不使用的-20℃保存

RNA保存RNA樣品溶于無(wú)RNA酶水中，-80℃保存;長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中34核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023常用的核酸實(shí)驗(yàn)流程組織培養(yǎng)的細(xì)胞外周血細(xì)菌RNA提取DNA提取cDNA逆轉(zhuǎn)錄普通PCR熒光定量PCR多重PCR電泳凝膠成像35核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR技術(shù)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)簡(jiǎn)稱ＰＣＲ技術(shù)，是一種體外擴(kuò)增特異ＤＮＡ片段的技術(shù)。ＰＣＲ技術(shù)操作簡(jiǎn)便，可在短時(shí)間獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異的目的ＤＮＡ序列的拷貝。80年代中期ＰＣＲ技術(shù)的發(fā)明，引起了生物技術(shù)發(fā)展的一次革命，目前已被廣泛應(yīng)用于與分子生物學(xué)相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域。/genetics/PCR/PCR.htm36核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高簡(jiǎn)便、快速對(duì)標(biāo)本的純度要求低37核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR原理模板DNA95℃高溫變性/genetics/PCR/PCR.htm38核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202355℃引物1引物2DNA引物低溫退火39核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶中溫延伸40核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023第1輪結(jié)束95℃第2輪開始高溫變性41核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增42核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系n×擴(kuò)增緩沖液

4種dNTP混合物

TaqDNA聚合酶

Mg2+

雙蒸水

引物

模板DNA混合液試劑公司合成DNAcDNA43核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）44核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增常用軟件primer545核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023驗(yàn)證引物特異性

BLAST是BasicLocalAlignmentSearchTool的英文縮寫，意即堿基局部對(duì)準(zhǔn)檢索工具，是一種序列類似性檢索工具。它采用統(tǒng)計(jì)學(xué)記分系統(tǒng)，能將真正配對(duì)的序列同隨機(jī)產(chǎn)生的干擾序列區(qū)別開來(lái)即采用的是局部對(duì)準(zhǔn)算法(LocalAlignmentAlgorithm)，而不是全序列對(duì)準(zhǔn)算法(GlobalAlignmentAlgorithm)。/blast/Blast.cgi46核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20231atggggggctggtttgcacaccccatcttcaaaaacggagactaccctgaggtgatgaag61acacggattcgtgacagaagcctggcggcaggcctcaacaagtccaggctccctgaattt121acagagagcgagaagaagatccagagcacctttgacttttttgggttcaaccactacacc181actgtcctagcctacaacctcaactacgccgctgctgtttcgtcttttgatgccgatagg241ggagttgcttccattacagaccgctcctggccagactctggctccttctggctgaagatg301accccttttggcttccggaggatcttgaactggttgaaggaggagtacaacaaccctcta361atttatgtcacagagaatggagtgtcccgacgaggagacccagaactcaatgacaccgac421aggatctactacctccgcagctacattaatgaagccctcaaagctgtacgagataaggtg481gaccttcgagggtacacggtctggagcatcatggacaactttgaatgggccacaggcttc541gcagagaggttcggcgtgcactttgtgaaccgctctgacccttctttgccaaggatcccc601aaggcgtcagccaaggtctacgcctccatagtccgctgcaatggctttcctgaccctgca

47核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202348核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023引物序列輸入窗口ATGTTGGGGAAATGCTTGACC數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇在此，我們選擇第三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)程序的選擇顯示結(jié)果在新的窗口點(diǎn)擊此按鈕，進(jìn)入結(jié)果頁(yè)面輸入方法可先輸入上游引物，進(jìn)行blast程序，同樣方法在進(jìn)行下游引物的blast程序。在結(jié)果分析特異性時(shí)要看能與上游引物的匹配的系列，還要看與下游引物匹配的系列——之后看兩者的交叉。49核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023等待若干秒之后，出現(xiàn)resultsofBLAST的網(wǎng)頁(yè)。該網(wǎng)頁(yè)用三種形式來(lái)顯示blast的結(jié)果。（1）圖形格式通過點(diǎn)擊相應(yīng)的bar可以得到匹配情況的詳細(xì)信息。50核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023（2）結(jié)果信息概要：從左到右分別為：A、數(shù)據(jù)庫(kù)系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序列的信息B、系列的簡(jiǎn)單描述C、高比值片段對(duì)（high-scoringsegment

pairs,HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的計(jì)算公式＝匹配的堿基×2＋0.1。舉例：如果有20個(gè)堿基匹配，則其得分為40.1。D、E值：代表被比對(duì)的兩個(gè)序列不相關(guān)的可能性。E值最低的最有意義，也就是說(shuō)序列的相似性最大。設(shè)定的E值是我們限定的上限，E值太高的就不顯示了E、最后一欄有的有UEG的字樣，其中U代表：Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)E代表：GEOprofiles數(shù)據(jù)庫(kù)G代表：Gene數(shù)據(jù)庫(kù)ABCDE51核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023（3）結(jié)果詳細(xì)信息序列的信息上游引物與該序列的正鏈【Plus/Plus】的匹配情況：共有21個(gè)堿基匹配，得分42.1分【21×2＋0.1＝42.1】，E值為0.014上游引物與序列的1～21位點(diǎn)匹配52核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023結(jié)果判斷：①驗(yàn)證文獻(xiàn)報(bào)道的引物是否正確：如果你可以在所顯示的結(jié)果中找出你的目的基因，一般說(shuō)明你的引物正確性沒問題。如果你blast后沒有發(fā)現(xiàn)你的目的基因，或者分值很低，該引物就可能不適合用②檢測(cè)該對(duì)引物是否可與其它序列匹配，引起PCR的非特異性擴(kuò)增。如果找到了你的目的基因名稱，而且找到了一大批同物種的不同基因，（上下游引物分別搜索到相同的基因），而且分?jǐn)?shù)也較高。這時(shí)表明你的引物設(shè)計(jì)的特異性不高，極有可能在你的擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。53核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)54核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023溫度與時(shí)間的設(shè)置：標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗55核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想56核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023③延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些57核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多58核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023瓊脂糖凝膠制作

瓊脂糖的濃度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。一般RNA凝膠用1%濃度，PCR產(chǎn)物用2%凝膠濃度（%）線性DNA長(zhǎng)度（bp）0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～200059核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023正確選擇凝膠濃度

對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2％之間，低濃度的用來(lái)進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來(lái)進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

60核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023電泳的合適電壓和溫度

電泳時(shí)電壓一般用80-150伏，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象61核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023DNA、RNA的上樣

正確的DNA、RNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。PCR產(chǎn)物一般2-5即可。62核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023步驟如下：

1.制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用50ml,小膠用30ml):稱取0.5g(0.3g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入50ml(30ml)0.5×TBE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,搖勻,室溫涼至微熱（60°C左右），加入EB（0.5ug/ml），搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液.例如：63核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023

2.膠板制備:制膠槽洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.將內(nèi)槽置于水平位置,放好梳子.將冷卻到60℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,形成均勻膠層.室溫下靜置至完全凝固,垂直輕拔梳子。避免氣泡的產(chǎn)生，操作要輕柔。

64核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20233.點(diǎn)樣:在EP管中混合DNA樣品和上樣緩沖液,上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X.加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面例如：我們加3-5μl樣本時(shí)加1ul6X的loadingbuffer加marker做對(duì)照。一定要弄清楚marker各條帶片段的大小

4.電泳:加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,電壓80-150V,樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動(dòng).電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低.當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1/3處時(shí),停止電泳.

65核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20236.觀察照相:在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存.66核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR實(shí)驗(yàn)新手入門首先合成引物、訂購(gòu)試劑以及一次性耗材

1.引物序列可以自己用軟件設(shè)計(jì)、源于文獻(xiàn)和公司設(shè)計(jì)

2.找公司設(shè)計(jì)時(shí)需要提供目的基因的全基因序列提取DNA或RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

驗(yàn)證所提取核酸的純度與濃度（凝膠電泳法或紫外分光光度法）摸索退火溫度引物Tm值上下5℃(是否有，特異性)找出最佳反應(yīng)條件PCR時(shí)加對(duì)照確保反應(yīng)體系各種試劑好用摸索實(shí)驗(yàn)：67核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR實(shí)驗(yàn)新手入門先少做、細(xì)做、嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)程序以及實(shí)驗(yàn)室指定區(qū)域進(jìn)行操作。常與老師和同學(xué)進(jìn)行交流遇到問題及時(shí)解決在努力奮斗的同時(shí)保持一顆平常心多查閱文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)階段68核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR常見問題1無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對(duì)樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解退火溫度太高69核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR常見問題2.非特異性擴(kuò)增引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多70核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR常見問題3.拖尾模板不純或降解Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多循環(huán)次數(shù)過多M1271核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR常見問題4.假陽(yáng)性交叉污染操作時(shí)防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；防止PCR產(chǎn)物污染各種試劑先進(jìn)行分裝，低溫貯存。設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)72核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023以RNA為模板，先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)利用內(nèi)參法分析目的基因表達(dá)量的情況由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因，目的基因和一個(gè)看家基因。RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）73核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023一種完全閉管式的PCR和熒光探針雜交技術(shù)相結(jié)合的定量PCR方法PCR的高效擴(kuò)增特性核酸探針的高特異性光譜技術(shù)的高靈敏性和可計(jì)量性Real-timePCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR)74核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針熒光染料

75核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023TaqMan熒光探針原理：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5‘－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。http://ipd.pps.tv/play_33K8AW.html?qq-pf-to=pcqq.c2c76核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023TaqMan熒光探針特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)模板每復(fù)制１次，就有１個(gè)探針被切斷，并有１個(gè)熒光信號(hào)被釋放。被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)和ＰＣＲ產(chǎn)物數(shù)是一對(duì)一的關(guān)系光密度同被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)也呈正比關(guān)系可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。不足由于采用熒光和淬滅基團(tuán)雙末端標(biāo)記，因此淬滅難以徹底，本底較高。報(bào)告基團(tuán)的水解利用的是Ｔａｑ酶的５’一３’外切活性，因此定量時(shí)容易受酶活性影響。探針標(biāo)記成本較高77核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202378核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202379核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023Ct值的定義在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

80核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202381核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202382核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023定量原理83核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202384核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202385核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023SYBR熒光染料原理ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ是一種能結(jié)合到雙鏈ＤＮＡ小溝部位的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，它只有與ｄｓＤＮＡ結(jié)合后才會(huì)發(fā)出熒光。在變性時(shí)，ＤＮＡ雙鏈分開，不產(chǎn)生熒光；在復(fù)性和延伸時(shí)，形成ｄｓＤＮＡ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ發(fā)出熒光因此，熒光強(qiáng)度可以代表擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。86核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023SYBR熒光染料特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：成本較低，不需合成和標(biāo)記探針；適合初步篩查：選用ＳＹＢＲ篩查，再用探針法精確定量少數(shù)關(guān)鍵樣品。不足：特異性差，不能分辨主帶與雜帶。但可利用熔點(diǎn)曲線分析將特異產(chǎn)物、引物二聚體和非特異性產(chǎn)物區(qū)別開來(lái)，不需要通過電泳鑒定不能做多重檢測(cè)，每孔只能檢測(cè)１個(gè)目標(biāo)基因；靈敏度低，適合于５０００拷貝以上的基因定量。87核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/202388核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用DNA或RNA的絕對(duì)定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等?；虮磉_(dá)差異分析。例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證基因分型。例如SNP檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。

89核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023FQ-PCR與普通PCR的區(qū)別采用閉管檢測(cè)，不需PCR后處理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系統(tǒng)，擴(kuò)增和檢測(cè)一次同時(shí)完成。不需開蓋，不產(chǎn)生污染。避免了假陽(yáng)性。探針與被檢DNA序列特異雜交，增強(qiáng)了特異性。90核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況。光譜分析儀直讀結(jié)果，自動(dòng)分析，增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。91核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR產(chǎn)物污染問題2、還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染：在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。92核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023PCR產(chǎn)物污染問題PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題.因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。93核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023目前常見PCR產(chǎn)物污染問題PCR產(chǎn)物污染自己的實(shí)驗(yàn)體系PCR產(chǎn)物污染環(huán)境進(jìn)而污染他人他人的PCR產(chǎn)物污染自己解決辦法：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范進(jìn)行操作。每次PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要加陰性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)到指定區(qū)域進(jìn)行?？刂芇CR產(chǎn)物污染人人有責(zé)。94核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023二、PCR相關(guān)技術(shù)基因克隆SSCP、RFLP雜交（southern/northern、原位雜交）芯片雜交測(cè)序95核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023基因克隆1、分離目的基因2、切割目的基因和基因載體3、連接目的基因和基因載體4、轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞5、篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆96核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023SSCP、RFLPSSCP：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性，是一種基于DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）用于檢測(cè)DNA序列多態(tài)性。先將待測(cè)的靶DNA片段進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，然后應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后經(jīng)電泳分析靶DNA片段是否被切割而分型。97核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023三、分子平臺(tái)使用流程及規(guī)范（一）分子平臺(tái)實(shí)驗(yàn)區(qū)域（二）儀器的使用規(guī)范98核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023（一)分子平臺(tái)實(shí)驗(yàn)區(qū)域?qū)嶒?yàn)室分為三個(gè)區(qū)；RNA提取專用區(qū)，DNA提取室，PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)嚴(yán)格遵守各區(qū)域?qū)Ｓ?，禁止混用進(jìn)入PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)，帶進(jìn)去的東西一律不準(zhǔn)帶出。不做分子實(shí)驗(yàn)的同學(xué)禁止進(jìn)入分子實(shí)驗(yàn)室。為了大家共同利益請(qǐng)愛護(hù)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備以及環(huán)境99核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20231、標(biāo)本制備、RNA提取室用途：RNA專用提取室儀器：生物安全柜和低溫高速離心機(jī)注意事項(xiàng)：使用前進(jìn)行預(yù)約登記嚴(yán)格按照各儀器設(shè)備使用規(guī)范進(jìn)行操作使用后及時(shí)做好清潔工作。100核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20232、標(biāo)本制備、DNA提取室用途：DNA提取、組織研磨以及核酸紫外檢測(cè)儀器：生物安全柜、超凈工作臺(tái)、低溫高速離心機(jī)、PCR儀器（做逆轉(zhuǎn)錄用）和超微量紫外分光光度計(jì)注意事項(xiàng)：嚴(yán)格按照各儀器設(shè)備使用規(guī)范進(jìn)行操作請(qǐng)愛護(hù)儀器設(shè)施，使用后及時(shí)做好清潔工作。101核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/20233、PCR反應(yīng)及產(chǎn)物分析區(qū)使用注意事項(xiàng)用途：為PCR反應(yīng)及PCR產(chǎn)物分析專用區(qū)儀器：水平制膠槽、微波爐、水平電泳儀、PCR儀和凝膠成相系統(tǒng)注意事項(xiàng)：嚴(yán)格按照指定區(qū)域進(jìn)行特定操作，切忌混用以免造成污染勿將PCR產(chǎn)物、凝膠、本室的一切物品和設(shè)備帶出本室102核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023實(shí)驗(yàn)室垃圾的處理提取室的槍頭等一次性物品一定要用塑料袋包好后扔到各實(shí)驗(yàn)區(qū)域指定的位置。PCR產(chǎn)物分析室的點(diǎn)樣槍頭、凝膠一定要包好后扔到指定區(qū)域。103核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023

（二）儀器的使用規(guī)范使用前熟悉儀器設(shè)備的使用方法和注意事項(xiàng)使用時(shí)進(jìn)行登記輕柔操作使用后注意關(guān)閉電源做好清潔工作104核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023使用方法：檢查電源電壓是否匹配后，接通電源。生物安全柜工作前必須預(yù)先打開風(fēng)機(jī)。生物安全柜工作時(shí)先關(guān)閉紫外燈,工作時(shí)不要將移門移過安全線的高度。

注意事項(xiàng):工作臺(tái)面禁放不必要的物品，以保持工作區(qū)的潔凈氣流不受干擾。禁止在工作臺(tái)面上記錄書寫，工作時(shí)盡量避免作明顯擾動(dòng)氣流的動(dòng)作；禁止在預(yù)過濾進(jìn)風(fēng)口部位放置物品，以免擋住進(jìn)風(fēng)口造成進(jìn)風(fēng)量減少，降低凈化能力。生物安全柜使用后即刻以5%施康消毒液洗擦工作臺(tái)面，再以75%酒精擦一次；紫外燈消毒30分鐘后關(guān)機(jī)。使用后做好登記將垃圾包好扔到指定的位置生物安全柜內(nèi)的加樣器只能在該柜內(nèi)使用生物安全柜使用操作流程

105核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023加樣器使用注意事項(xiàng)使用前注意加樣器的使用方法注意調(diào)節(jié)的方向。禁止調(diào)節(jié)超過最大量程輕拿輕放，注意加樣器的清潔。什么地方的加樣器只在該位置使用106核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023離心機(jī)使用規(guī)范

離心前先將待離心物品的管壁擦干凈，必須配平

先蓋好離心機(jī)內(nèi)蓋再蓋外蓋，離心后將離心機(jī)外蓋打開

用水池上面的抹布將離心機(jī)擦拭干凈，白天不用關(guān)電源

晚上最后一個(gè)使用者關(guān)閉電源低溫離心后一定將蓋子打開，晾干水汽107核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座7/26/2023掌上離心機(jī)使用規(guī)范用途：試劑、樣品等短暫離心注意事項(xiàng)：配平、清潔和僅在指定區(qū)域內(nèi)使用108核酸檢測(cè)專題知識(shí)講座