昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設計課件

昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設計(ppt)（優(yōu)選）昆醫(yī)分生蛋白質(zhì)分子建模與設計ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsUnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunction引言在人體的進化過程中蛋白質(zhì)執(zhí)行了在人體及體外的許多重要任務：酶是催化化學反應的蛋白質(zhì)或者核酸分子；抗體起到防護的作用;……從生態(tài)角度，蛋白質(zhì)也是非常理想的物質(zhì):生物合成不需要消耗很多能量專一性很強不產(chǎn)生副作用并且能很快降解蛋白質(zhì)沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:(1)蛋白質(zhì)分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學方法生產(chǎn);(2)蛋白質(zhì)的功能是在生理條件下?lián)]發(fā)的，在其它條件下(如在有機溶劑中)是不穩(wěn)定的;(3)專一性致使其應用范圍受到影響。

蛋白質(zhì)應用受限的原因蛋白質(zhì)設計目前存在的問題1、與天然的蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構的獨特性及明顯的功能優(yōu)越性2、三級結(jié)構的確定性較差計算機模擬突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析基因構建Pr設計循環(huán)第一節(jié)蛋白質(zhì)分子設計原理蛋白質(zhì)分子設計的流程天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構預測蛋白質(zhì)晶體學蛋白質(zhì)三維結(jié)構結(jié)構與功能的關系蛋白質(zhì)突變體設計及結(jié)構預測幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學研究結(jié)果分析與原先的結(jié)構比較蛋白質(zhì)合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的輸入Pr突變體設計的3個步驟利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的aa利用能量優(yōu)化及動力學方法預測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構預測的結(jié)構與原始的Pr結(jié)構比較，利用Pr結(jié)構-功能或結(jié)構穩(wěn)定相關知識及理論計算機預測新Pr可能具有的性質(zhì)在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結(jié)合

在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結(jié)合

蛋白質(zhì)分子設計原理內(nèi)核假設。蛋白質(zhì)的獨特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用決定。（內(nèi)部十分保守的區(qū)域）Pr內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結(jié)合一個水分子或惰性氣體），沒有重疊所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所取代疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應的主要驅(qū)動力

蛋白質(zhì)分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用。

蛋白質(zhì)分子設計原理最優(yōu)的aa側(cè)鏈幾何排列。Pr側(cè)鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)結(jié)構及功能的專一性。這是Pr設計最困難的問題

蛋白質(zhì)分子設計原理一、蛋白質(zhì)分子設計的分類設計的目的主要有兩個：

一是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設計方案和指導性信息，如以此提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

二是探索蛋白質(zhì)的折疊機理，如簡單蛋白質(zhì)骨架的從頭設計是研究蛋白質(zhì)內(nèi)相互作用力的類型及本質(zhì)的很好途徑，也為解決蛋白質(zhì)折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。

（一）蛋白質(zhì)分子設計的層次分為兩個層次：一是在蛋白質(zhì)三維結(jié)構已知基礎上的分子設計；二是在三維結(jié)構未知的情況下，借助一級結(jié)構序列信息及生物化學性質(zhì)進行分子設計工作。（二）蛋白質(zhì)分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法2．拼接組裝設計法3．從頭設計全新蛋白質(zhì)二、蛋白質(zhì)分子設計的原則1．活性設計2．對專一性的設計3．Scaffold設計(框架)4．疏水基團與親水基團需合理分布5．最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列溶菌酶結(jié)構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計過程中，其中EFAEEAASF多肽能水解幾丁質(zhì)和葡聚糖，但糖苷酶活性較低。

Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。設計步驟蛋白質(zhì)分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質(zhì)序列合成檢測結(jié)構信息分析建立結(jié)構模型設計目標蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設計全β結(jié)構時，應選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設計轉(zhuǎn)角時常選擇Pro-Asn殘基對。第二節(jié)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構的分子設計基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構的分子設計有兩類：一是進行蛋白質(zhì)修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進行蛋白質(zhì)分子裁剪拼接，即“中改”。

一、定位突變

基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對已知結(jié)構的蛋白質(zhì)進行少數(shù)幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質(zhì)工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質(zhì)修飾和基因定位突變兩類。（一）定位突變的設計目標及解決方法

定位突變常見的設計目標是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進行結(jié)構-功能關系的研究等。Hartley等于1986年完成了一個我們所要的設計目標及解決的辦法：熱穩(wěn)定性對氧化的穩(wěn)定性對重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學性質(zhì)引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)，改變酸堿度（二）定位突變的種類

要進行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學合成、基因直接修飾法、盒式突變技術等。根據(jù)基因突變的方式，分為以下三類：插入一個或多個氨基酸殘基；刪除一個或多個氨基酸殘基；替換或取代一個或多個氨基酸殘基。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構模型

可以通過X射線晶體學、二維核磁共振等測定結(jié)構，也可以根據(jù)類似物的結(jié)構或其他結(jié)構預測方法建立起結(jié)構模型。2．找出對所要求的性質(zhì)有重要影響的位置在改造中如何恰當?shù)剡x擇突變殘基是一個關鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質(zhì)，同時還需要借助于已有的三維結(jié)構或分子模型。3．預測突變體的結(jié)構

根據(jù)所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結(jié)構預測，將預測的結(jié)構與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構比較；利用蛋白質(zhì)結(jié)構-功能或結(jié)構-穩(wěn)定性相關知識及理論計算預測新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)；同時利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學方法預測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構，以修正所選擇的氨基酸位點和突變后的氨基酸種類。4．構建突變體，獲得突變體蛋白

依據(jù)所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質(zhì)，獲得所設計的新蛋白質(zhì)。5．突變體蛋白質(zhì)的檢驗測定新蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構、穩(wěn)定性、催化活性等，并與對應的天然蛋白質(zhì)進行比較，檢驗突變設計的效果，同時進一步修正設計方案。蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定根據(jù)結(jié)構信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定1．根據(jù)結(jié)構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構，通過分析該酶的Cys35被結(jié)構相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。2．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進另外一種突變來檢測隨機突變技術刪除分析及連接片段掃描突變3．利用蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結(jié)構有關。非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。探測突變蛋白質(zhì)的結(jié)構整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。（五）定位突變的應用RNaseT1的結(jié)構改造是分于設計中的一個成功實例T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩(wěn)定性增加。二、蛋白質(zhì)分子拼接例如，有一種和癌癥的發(fā)病有關的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個大小和形狀都非常相似的結(jié)構域拼接構成的，各結(jié)構域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發(fā)現(xiàn)，癌胚抗原的這種多結(jié)構域特征有利于它的細胞識別和粘合作用。英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分子上作了實驗(人源化抗體)單鏈抗體scFv結(jié)構/cmbidata/biotech/antibody/antibodyengnieer.htm（抗體工程)抗DON單鏈抗體改體研究DON:小麥鐮刀菌毒素

單鏈抗體的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL

單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH

Linker

XhoⅠSalISalⅠSalⅠXhoⅠ雙酶切EcoRIXhoⅠ雙酶切EcoRISalI雙酶切differentlength連接ＶＨＶＬ

技術路線EcoRI轉(zhuǎn)化篩選、檢測

蛋白質(zhì)的誘導生成

表達載體構建

感受態(tài)細胞的制備純化親和力初步測定PCR擴增重鏈、輕鏈策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2PCR反應體系及反應條件50L反應體系如下：10×TaqPCRBuffer5μLdNTP(2.5mM)3μLForwardPrimer(20mM)1μLReversePrimer(20mM)1μLTemple1μLrTaq0.3μL

AddddH2Otoafinalvolumeof50μLPCR循環(huán)條件為：94℃5min，1個循環(huán)；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31個循環(huán)；72℃40s，25個循環(huán)；72℃7min，1個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5μL，1.0％的瓊脂糖電泳檢測。VH

和VL的PCR擴增結(jié)果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000

菌落PCR重組子驗證123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100

改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD

改體抗體的ELISA初步測定312456789101112單鏈抗體抗體：是體液免疫應答的主要效應分子。由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）組成。雙特異性單鏈抗體的構建與表達單鏈抗體（scFv）：抗體可變區(qū)的重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過一段約15-25個氨基酸殘基構成的彈性短肽（Linker）相連，融合表達出來的抗體片斷。

雙特異性單鏈抗體能識別兩種抗原并能與之結(jié)合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。本實驗將能夠各自產(chǎn)生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達出能同時與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結(jié)合的雙特異性單鏈抗體。玉米赤霉烯酮(ZEN)技術路線

DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設計

PCR擴增目的片段

制備感受態(tài)細胞

酶切目的片段、載體，linker連接

轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物

酶切驗證重組子

表達、純化蛋白載體的構建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ連接

LinkerPCR擴增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500PCR擴增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bp重組驗證PCR驗證以重組質(zhì)粒為模板，進行Anti-DON基因的PCR分析。雙特異性抗體的表達

我們知道,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構受其氨基酸序列控制,而功能又與結(jié)構密切相關。

如果能夠找到構造蛋白質(zhì)結(jié)構的方法,我們就能得到具有任意結(jié)構和功能的全新蛋白質(zhì),這就是蛋白質(zhì)全新設計問題。第三節(jié)全新蛋白質(zhì)設計

蛋白質(zhì)從頭設計概念

從頭設計能夠根據(jù)生物分子的活性位點特征產(chǎn)生一系列的結(jié)構片段，通過連接這些結(jié)構片段可以構成一個全新分子；或者在結(jié)合腔內(nèi)對一個已知的結(jié)構骨架進行化合物的衍生化。

從頭設計方法可以生成全新的分子結(jié)構。全新蛋白質(zhì)設計包括

一、全新蛋白質(zhì)設計方法二、蛋白質(zhì)結(jié)構的從頭設計

全新蛋白質(zhì)設計過程設計目標序列生成結(jié)構預測合成構建模型檢測（一）全新蛋白質(zhì)設計程序模擬分析設計實驗一、全新蛋白質(zhì)設計方法（二）全新蛋白質(zhì)設計目標的選擇依據(jù)設計的目的可以分為：從頭結(jié)構設計從頭功能設計從頭結(jié)構設計

中心問題：穩(wěn)定及獨特的三維結(jié)構序列；基本障礙：線性聚合構象熵；解決方法：（1）使相互作用的強度與數(shù)目達到最大；（2）共價交叉連接。從頭設計方法包含的步驟1、活性位點分析：對結(jié)合位點的具體的化學信息進行掃描、分析和歸類。這些信息的三維空間相互關系都必須充分考慮。

2、配體分子構建：采用不同的片段選擇和分子構建方法，產(chǎn)生相應的分子結(jié)構。

3、評價：使用特定的評分系統(tǒng)將構建的分子與活性位點的匹配性進行排序，可以選擇其中優(yōu)良的結(jié)果作為合成實驗的對象。也可以將之做新一輪計算的起點進行進一步的優(yōu)化。二、蛋白質(zhì)結(jié)構的從頭設計（一）蛋白質(zhì)結(jié)構的從頭設計原則1．二級結(jié)構的設計原則α螺旋β折疊片轉(zhuǎn)角2．超二級結(jié)構和三級結(jié)構的設計原則α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-β折疊片

(HPHPH或PHPHP，5-10aa)轉(zhuǎn)角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）

蛋白質(zhì)的幾種超二級結(jié)構

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β從頭設計的三股式β折疊

從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白質(zhì)結(jié)構的從頭設計實例結(jié)構骨架模板、分級迭