DNA甲基化檢測(cè)方法-課件

DNA甲基化檢測(cè)方法1PPT課件DNA甲基化檢測(cè)方法總覽2PPT課件

主要檢測(cè)途徑基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法(金標(biāo)準(zhǔn))不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法3PPT課件基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法質(zhì)譜分析水解核苷酸質(zhì)譜分析4PPT課件基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理15PPT課件基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理26PPT課件

應(yīng)用一:直接測(cè)序法（Directsequencing)

用于甲基化分析的樣本常常是混合樣本，不適合直接直接進(jìn)行sanger測(cè)序分析7PPT課件

直接測(cè)序法8PPT課件圖6PMVK基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測(cè)序結(jié)果9PPT課件圖7TRIB3基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測(cè)序結(jié)果10PPT課件應(yīng)用二：重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測(cè)序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)11PPT課件12PPT課件

注：A：癌組織；B：癌旁組織；○-：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆測(cè)序結(jié)果13PPT課件BSP克隆測(cè)序甲基化率三維圖形14PPT課件優(yōu)點(diǎn):能準(zhǔn)確的檢測(cè)出每個(gè)DNA分子單倍體型的

甲基化狀態(tài)，同時(shí)能分析不同CpG位點(diǎn)之間

的甲基化狀態(tài)的聯(lián)系。缺點(diǎn)：需要對(duì)PCR產(chǎn)物克隆，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)

力，克隆子的數(shù)目影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

測(cè)序重復(fù)性差。15PPT課件應(yīng)用三：甲基化特異性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)16PPT課件17PPT課件18PPT課件UMUMUMladder100150200250MSP法檢測(cè)抑癌基因RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)的甲基化圖MSP檢測(cè)組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化。19PPT課件

MSP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖研究結(jié)果注：M表示甲基化，U表示未甲基化

B1-B6為高脂血癥組六例標(biāo)本，D1-D5為正常對(duì)照組五例標(biāo)本；H2O為陰性對(duì)照；m為50bpMarker。SREBP-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)20PPT課件甲基化特異性PCR優(yōu)點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)便；②敏感性高；③Nested-MSP提高靈敏度，便于分析微量檢材缺點(diǎn)：①引物設(shè)計(jì)要求高；②只能作定性研究；③存在重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性；④只能了解部分位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。21PPT課件MethyLight對(duì)MSP的產(chǎn)物用Taqman探針進(jìn)行qPCR，從而實(shí)現(xiàn)甲基化的定量分析。優(yōu)點(diǎn)：增加了重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和DNA復(fù)性的質(zhì)控對(duì)照

避免了電泳、酶切等操作缺點(diǎn)：PCRbias22PPT課件應(yīng)用四：結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)23PPT課件結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法24PPT課件基于限制性內(nèi)切酶的工具酶甲基化特異性的限制性內(nèi)切酶(MDRE)：可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶(MSRE)：可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶25PPT課件基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法26PPT課件MSRE-PCR原理圖1-1MSRE-PCR原理圖注：左圖DNA無(wú)甲基化,DNA被切斷,無(wú)法得到PCR產(chǎn)物;右圖DNA有甲基化,DNA保持完整,可以獲得PCR產(chǎn)物.27PPT課件應(yīng)用舉例二：采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶技術(shù)結(jié)合PCR的方法（MSRE-PCR）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因。28PPT課件圖1-3：DNM基因瓊脂糖凝膠電泳圖M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶體系；A：癌組織；B：癌旁組織；空：水空白29PPT課件酶識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)含有一個(gè)及以上CpG位點(diǎn)應(yīng)用條件：30PPT課件結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法優(yōu)點(diǎn)：①方法相對(duì)簡(jiǎn)單；②可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；③需要樣本量少。31PPT課件缺點(diǎn)：①由于CG僅限于內(nèi)切酶識(shí)別序列中，因此非識(shí)別序列的CG將被忽略；②只有檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測(cè)方法的結(jié)果才有意義；④存在酶消化不完全引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題；結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法32PPT課件應(yīng)用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP)33PPT課件基本步驟34PPT課件舉例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmousePrimeraredesigned

toflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.35PPT課件LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.36PPT課件ThedifferenceintheCt

valueofanenzyme-digestedtemplaterelativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevelsofDNAmethylationineachtissue.MSREMDRE37PPT課件

應(yīng)用六：基于親和純化的甲基化分析方法

38PPT課件

基于親和純化的甲基化分析方法

39PPT課件40PPT課件應(yīng)用七：ChIP-Seq技術(shù)

41PPT課件

ChIP-Seq

42PPT課件應(yīng)用八：芯片技術(shù)在甲基化檢測(cè)中的應(yīng)用43PPT課件啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù)44PPT課件基因芯片雜交信號(hào)圖45PPT課件46PPT課件47PPT課件應(yīng)用九、質(zhì)譜技術(shù)（Mass

SpectromericAnalysisofCytosineMethylationbyBase-SpecificCleavageandPrimerExtensionMethods）48PPT課件如圖所示切下的每個(gè)片段含有一個(gè)或兩個(gè)CpG位點(diǎn)，在質(zhì)譜圖上甲基化片段和未甲基化片段大小相差16Da或32DaBase-SpecificCleavage49PPT課件PrimerExtensionMethods50PPT課件如圖所示，用ddC和ddT終止延伸后，在質(zhì)譜圖上顯示出甲基化組（ddC）和未甲基化組(ddT)的質(zhì)譜峰,二者相差16Da。51PPT課件Base-SpecificCleavage檢測(cè)的是一個(gè)酶切后片段的甲基化狀態(tài)，用于在長(zhǎng)片段DNA序列（如基因啟動(dòng)子區(qū)域）中篩選甲基化位點(diǎn)并確定每個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化程度，而在基因的甲基化譜確定后可以用PrimerExtensionMethods精確的對(duì)每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量檢測(cè)，PrimerExtensionMethods最多可以實(shí)現(xiàn)25個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。52PPT課件質(zhì)譜法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：靈敏度準(zhǔn)確性高。操作較簡(jiǎn)便。局限性：DNA樣本要求純度較高，提取過(guò)程中的小離子，未消化完全的蛋白，RNA對(duì)結(jié)果有干擾作用。需用質(zhì)譜儀。53PPT課件應(yīng)用十、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法（methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)）54PPT課件擴(kuò)增基因組DNA樣本重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ExoSAP消化PCR引物延伸加入SNP引物和SNaPshotMixSNP引物延伸(加入ddT或ddC)SAP處理分析310/3100樣本準(zhǔn)備加入GS120LIZ內(nèi)標(biāo)ABI310/3100電泳選用E5和POP4膠數(shù)據(jù)分析（GeneScan）樣本分型（Genotyper或GeneMapperID）步驟55PPT課件123456這是一個(gè)多重SNaPshot的檢測(cè)結(jié)果，總共檢測(cè)了6個(gè)CpG位點(diǎn)，陰影峰代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位點(diǎn)1、2和4顯示大約50%的甲基化率，而位點(diǎn)3、5和6顯示0的甲基化率。56PPT課件應(yīng)用十一：高分辨熔解曲線分析

MS-HRM

57PPT課件HRM技術(shù)：用于篩選大量樣本，獲得感興趣的CpG位點(diǎn)鑒定感興趣的CpG

島。58PPT課件HRM技術(shù)原理59PPT課件HRM技術(shù)原理60PPT課件HRM特點(diǎn)高靈敏性：可檢測(cè)低達(dá)0.1%甲基化程度。高通量：1次可同時(shí)檢測(cè)不超過(guò)384樣本，適用于大樣本多位點(diǎn)甲基化掃描。高重復(fù)性：重復(fù)性100%。使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限。

操作簡(jiǎn)便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無(wú)須序列特異性探針，無(wú)需測(cè)序。標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)。

缺點(diǎn)：檢測(cè)序列長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)100bp；

只能進(jìn)行半定量檢測(cè)61PPT課件應(yīng)用十二：焦磷酸測(cè)序法62PPT課件焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing）63PPT課件焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing）64PPT課件焦磷酸測(cè)序65PPT課件焦磷酸測(cè)序66PPT課件焦磷酸測(cè)序67PPT課件焦磷酸測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：靈敏度高，可測(cè)到鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測(cè)序的引物區(qū)域。除常規(guī)的檢測(cè)位點(diǎn)變化情況外，還可準(zhǔn)確計(jì)算頻率變化。

對(duì)于檢測(cè)位點(diǎn)要求低，可檢測(cè)未知序列信息，覆蓋到人類基因組的所有CpG位點(diǎn)；對(duì)于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和FFPE樣本。68PPT課件69PPT課件應(yīng)用十三：QuantificationofMethylatedDNAbyHeavyMethyl

DuplexPCR70PPT課件PrincipleofHeavyMethyl(A)WhentheDNAismethylated,theblockeroligonucleotides(solidblack)donotbind,leavingtheprimerbindingsiteaccessiblefortheprimers(grayarrows)tobindandamplifythetarget.Theamplicationisdetectedwithamethylationspecificoligonucleotideprobe[solidblack,labeledwithfuorescentdye(F)andquencher(Q)ina5’-exonucleaseassay,usedhereasanexampleforareal-timedetectionmethod].(B)WhentheDNAisunmethylated,theblockeroligonucleotidesbind,blockingtheaccessoftheprimerstotheirbindingsites.NoPCRproductisgenerated.71PPT課件samplethroughputversusgenomecoverage.AplotofsamplethroughputagainstgenomecoverageforvariousDNAmethylationtechniques.Throughputisdeterminedbythenumberofsamplestha