HPLC(儀器圖)解讀課件

高效液相色譜法(HPLC)

highperformanceliquidchromatograph2023/7/23高效液相色譜法(HPLC)

2021

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相

、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。概述2023/7/23概述2023/7/232發(fā)展：1960年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。20世紀(jì)60年代末科克蘭（Kirkland）、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、哈伯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。

2023/7/23發(fā)展：2023/7/233高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。

1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。

2023/7/23高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板41970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問(wèn)題，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到改變流動(dòng)相的組成提高選擇性的關(guān)鍵。

2023/7/231970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。195一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1-3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）分析周期長(zhǎng)無(wú)法在線檢測(cè)2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2-6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動(dòng)相柱效高（H↓，n↑）分析時(shí)間大大縮短可以在線檢測(cè)2023/7/23一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢62023/7/232023/7/237二、HPLC與GC差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)占有機(jī)物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè),用途廣泛，占有機(jī)物的80%2023/7/23二、HPLC與GC差別1．分析對(duì)象2023/7/238相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別2023/7/23相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)2023/7/2392．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用

3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?023/7/232．流動(dòng)相差別3．操作條件差別2023/7/2310

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖：一般可分為五個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng),檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。第三節(jié)高效液相色譜儀2023/7/23

第三節(jié)高效液相色譜儀2023/7/2311

第三節(jié)高效液相色譜儀2023/7/23

第三節(jié)高效液相色譜儀2023/7/23122023/7/232023/7/23132023/7/232023/7/2314Agilent1200液相色譜系統(tǒng)2023/7/232023/7/23152023/7/232023/7/2316

高效液相色譜儀的儀器流程(processandmainassemblyofHPLC)高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng)2023/7/23

高效液相色譜儀的儀器流程(processandm172023/7/232023/7/23181.高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液泵:主要部件之一，壓力：15～35MPa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性（動(dòng)畫）(二).主要部件2023/7/231.高壓輸液系統(tǒng)（動(dòng)畫）(二).主要部件2023/7/2319流動(dòng)相的預(yù)處理：在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡抽真空脫氣吹氦脫氣加熱回流脫氣超聲波脫氣2023/7/232023/7/2320等強(qiáng)度洗脫（isocratic):樣品的組成較簡(jiǎn)單，各組分的分配系數(shù)值相差不大。在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒定。梯度洗脫（gradient)：樣品的組成較復(fù)雜，各組分的分配系數(shù)值相差大，即寬分配比的組分流動(dòng)相的洗脫方式2023/7/23等強(qiáng)度洗脫（isocratic):樣品的組成較簡(jiǎn)單，各組分的21●梯度洗脫的特點(diǎn)●梯度洗脫的主要條件●梯度洗脫的基本原理梯度洗脫（溶劑程序）：在同一個(gè)分析周期內(nèi)按一定的程序改變流動(dòng)相的組成,從而改變流動(dòng)相極性、離子強(qiáng)度、pH，來(lái)調(diào)整組分的k值，改變分離因子α值，以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。梯度洗脫（gradient)2023/7/23●梯度洗脫的特點(diǎn)梯度洗脫（溶劑程序）：在同一個(gè)分析周期內(nèi)按一221．梯度洗脫的特點(diǎn)（1）提高分離度，加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,（3）提高檢測(cè)的靈敏度，有利于痕量組分的檢測(cè)；（4）增加峰容量；（5）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長(zhǎng)期良好；梯度洗脫的作用2023/7/231．梯度洗脫的特點(diǎn)（1）提高分離度，加快分析速度；梯度洗脫的23(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/7/23(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極242．梯度洗脫的主要條件①A流動(dòng)相/弱溶劑組成；②B流動(dòng)相/強(qiáng)溶劑組成；③梯度時(shí)間；④梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強(qiáng)溶劑

A%time1252023/7/232．梯度洗脫的主要條件①A流動(dòng)相/弱溶劑組成；強(qiáng)溶劑25

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2.進(jìn)樣系統(tǒng)2023/7/23流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥262023/7/232023/7/2327六通閥定量環(huán)LoadInject通廢液口進(jìn)柱定量環(huán)手動(dòng)進(jìn)樣器、六通閥、定量環(huán)2023/7/23六通閥定量環(huán)LoadInject通廢液口進(jìn)柱定量環(huán)手動(dòng)進(jìn)樣器28儀器：自動(dòng)進(jìn)樣器機(jī)械手樣品盤自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣100樣品盤、機(jī)器手、自動(dòng)洗針2023/7/23儀器：自動(dòng)進(jìn)樣器機(jī)械手樣品盤自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣100樣品盤、29高效分離柱:柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。分離系統(tǒng)2023/7/23高效分離柱:柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～430柱溫箱外掛架色譜柱、柱溫箱、色譜柱外掛架2023/7/23柱溫箱外掛架色譜柱、柱溫箱、色譜柱外掛架2023/7/23314.檢測(cè)系統(tǒng)

a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2023/7/234.檢測(cè)系統(tǒng)a.紫外檢測(cè)器2023/7/2332b.光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2023/7/23b.光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二33光電轉(zhuǎn)換元件是:光電二極管,即晶體硅(體積僅50ul),如Agilent1100型光電二極管陣列檢測(cè)器,波長(zhǎng)范圍為190-950nm對(duì)應(yīng)1024個(gè)光電二極管,平均0.74nm譜帶區(qū)間,由一個(gè)光電二極管接收.光電二極管陣列檢測(cè)器構(gòu)造2023/7/23光電轉(zhuǎn)換元件是:光電二極管,即晶體硅(體積僅50ul),如A342023/7/232023/7/2335當(dāng)復(fù)合光透過(guò)流通池后,被組分吸收,其透過(guò)光具有了組分的光譜吸收特征.此透過(guò)光被光柵分光后,形成組分的吸收光譜,照到光電二極管陣列裝置上,使每個(gè)納米光波的光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號(hào),給出組分的吸收光譜.本檢測(cè)器可以同時(shí)獲得樣品的色譜圖(C-t)及每個(gè)色譜峰的吸收光譜(A-入),得到三維光譜-色譜圖,可以同時(shí)得到定性和定量及色譜峰是否單一組分的信息.工作原理2023/7/23當(dāng)復(fù)合光透過(guò)流通池后,被組分吸收,其透過(guò)光具有了組分的光譜吸362023/7/232023/7/2337c.示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2023/7/23c.示差折光檢測(cè)器

（differentialrefr38示差折光檢測(cè)器2023/7/23示差折光檢測(cè)器2023/7/2339

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）2023/7/23高靈敏度、高選擇性；熒光檢測(cè)器

（fluorescenc40蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

(evaporativelightscatteringdetector,ELSD)此類檢測(cè)器是上世紀(jì)90年代出現(xiàn)的最新型的泛用檢測(cè)器.可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分的檢測(cè).但靈敏度低于紫外光度型.因而主要用于糖類,高分子化合物,高級(jí)脂肪酸及甾體類等幾十類化合物.構(gòu)造檢測(cè)機(jī)理蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）

evaporativelightscatteringdetector2023/7/23蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

(evaporativelightsc41步驟一：霧化柱洗脫液進(jìn)入霧化器針管，在針的末端，洗脫液和氮?dú)饣旌闲纬删鶆虻奈⑿§F狀液滴步驟二：流動(dòng)相的蒸發(fā)液滴流經(jīng)加熱的漂移管時(shí)，流動(dòng)相蒸發(fā)，樣品在溶劑蒸氣中形成霧狀微小顆粒，懸浮在溶劑蒸氣中步驟三：檢測(cè)樣品小顆粒進(jìn)入流動(dòng)池時(shí)，經(jīng)過(guò)一束激光,顆粒散射激光,經(jīng)硅晶體光電二極管檢測(cè)散射光，并產(chǎn)生電信號(hào)。2023/7/23步驟一：霧化柱洗脫液進(jìn)入霧化器針管，在針的末端，洗脫液42構(gòu)造構(gòu)造2023/7/23構(gòu)造構(gòu)造2023/7/2343檢測(cè)機(jī)理1.霧化過(guò)程:形成細(xì)小均勻的霧狀液滴2.流動(dòng)相蒸發(fā)過(guò)程:流動(dòng)相蒸發(fā),樣品分子形成霧狀顆粒.3.檢測(cè)過(guò)程:670nm激光束的照射,產(chǎn)生散射光,其被硅晶體光電二極管產(chǎn)生電信號(hào)工作原理2023/7/23檢測(cè)機(jī)理1.霧化過(guò)程:形成細(xì)小均勻的霧狀液滴工作原理20234