高級實驗技術(shù)實時熒光定量

高級實驗技術(shù)實時熒光定量2023/7/211第1頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)PCR的定量在PCR反應(yīng)中，理論上擴增產(chǎn)物的量與起始樣本中模板的含量成正比。但受多種因素的影響，其精確定量模板的可信度明顯不足。2023/7/212第2頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴增為指數(shù)擴增，每一擴增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴增效率，Yn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。2023/7/213第3頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA2023/7/214第4頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月影響PCR擴增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應(yīng)試劑的相對量樣本在擴增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低2023/7/215第5頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月定量的最佳時期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#2023/7/216第6頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴增分子的數(shù)目n : 擴增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysis2023/7/217第7頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月為克服上述不足，人們設(shè)計出包括內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、競爭、酶聯(lián)、尿苷酶降解等多種定量方法。2023/7/218第8頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法在不同的PCR反應(yīng)管中加入已知量的內(nèi)標(biāo)模板和引物，內(nèi)標(biāo)模板可由基因工程合成或采用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品。在樣品模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)模板也被擴增。二者的擴增產(chǎn)物可通過電泳或其它方法分離，以內(nèi)標(biāo)為對照進行樣本模板定量。2023/7/219第9頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法

在擴增檢測待測樣本的同時，擴增一系列稀釋的已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）如果在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴增產(chǎn)物/模板成線性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時擴增的待測樣本中PCR模板的相對量2023/7/2110第10頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法2023/7/2111第11頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法優(yōu)點：方法簡便，容易建立使用雙孔重復(fù)測定可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果甚至可排除管間的差異不能排除樣本間的差異2023/7/2112第12頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法缺點PCR反應(yīng)體系的微小區(qū)別也會對測定造成較大的影響在擴增效率上的差異，會使定量測定精密度和重復(fù)性不佳2023/7/2113第13頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月使用外標(biāo)定量的要求必須進行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以確定其應(yīng)用的局限性必須在擴增的指數(shù)期進行2023/7/2114第14頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月競爭法將含有一個新內(nèi)切酶位點的外源性模板加入PCR反應(yīng)管中，待測樣品模板與外源性模板用同一對引物進行擴增，經(jīng)內(nèi)切酶消化競爭性模板的產(chǎn)物成為兩個片段，通過電泳等分離檢測，根據(jù)已知模板的量推測未知模板的起始拷貝數(shù)。2023/7/2115第15頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月酶聯(lián)免疫利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固定在固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，檢測酶底物顯色情況，通過內(nèi)標(biāo)－標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)定量檢測的目的。2023/7/2116第16頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月酶聯(lián)雜交法捕獲探針（檢測TNF-α）

3'–TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2-5'檢測探針（檢測TNF-α）

3'-Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATCGGGTA-5'2023/7/2117第17頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

：NH2標(biāo)記的探針

：Biotin標(biāo)記的探針Avidin-HRP顯色系統(tǒng)

：NOS基團酶聯(lián)雜交法2023/7/2118第18頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月定量PCR

——動力學(xué)方法

首先，確定PCR擴增的效率（E）然后，根據(jù)相應(yīng)的公式計算原始模板數(shù)2023/7/2119第19頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月影響PCR擴增效率（E）的因素整個擴增過程中：E取決于：引物/靶核酸的雜交反應(yīng)試劑的相對量DNA聚合酶/靶核酸之比例*其他可能影響E的因素（系統(tǒng)之間的差異）樣本在擴增儀中的位置不同的臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的去除程度靶核酸鏈的再退火及酶過量可致Ev降低2023/7/2120第20頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月改良方法：極限稀釋分析首先將原始模板進行梯度稀釋然后對該稀釋系列進行PCR擴增測定最低的陽性樣本被認(rèn)為含有與一已知的標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列中最后的陽性樣本中相同量的PCR模板2023/7/2121第21頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

極限稀釋法示意圖2023/7/2122第22頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

極限稀釋法優(yōu)點：不需要特殊設(shè)備方法簡單缺點：2023/7/2123第23頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

極限稀釋分析的缺點①必須建立擴增反應(yīng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化：如初始含量、試劑濃度和比例、循環(huán)參數(shù)等②不同批次的PCR測定的效率有可能不同，因而測定重復(fù)性較差③含低拷貝數(shù)的樣本中存在高斯（Gaussian）（正態(tài)）分布。因此，為正確判定最低陽性樣本，必須對每一稀釋度多次重復(fù)測定

嚴(yán)格注意污染，避免假陽性的產(chǎn)生2023/7/2124第24頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月傳統(tǒng)PCR定量方法的特點和不足1.定量的準(zhǔn)確度：傳統(tǒng)PCR定量方法的共同特點是針對PCR擴增的最終產(chǎn)物進行分析。因受酶活性、擴增效率、尤其是平臺效應(yīng)等諸多因素的影響，檢測重現(xiàn)性極差，無法直接從終產(chǎn)物量推算出起始模板的精確含量。2023/7/2125第25頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月2.假陽性污染：傳統(tǒng)PCR定量方法均依賴于各種不同類型的PCR后處理過程，這些過程極易使數(shù)量巨大的PCR擴增產(chǎn)物飛散到實驗室的環(huán)境中，造成待檢樣本的污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的上升。傳統(tǒng)PCR定量方法的特點和不足2023/7/2126第26頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月實時熒光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對每一循環(huán)擴增反應(yīng)產(chǎn)物DNA片段的累積情況進行實時監(jiān)測記錄，通過數(shù)學(xué)模型實現(xiàn)對起始模板的定量及定性的分析。其特點為全封閉（污染少）、高精確、高靈敏。2023/7/2127第27頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月實時熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR：

通過電泳、酶聯(lián)等后處理技術(shù)，對PCR擴增反應(yīng)的終末產(chǎn)物進行定量及定性分析。實時熒光定量PCR：通過引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對PCR擴增反應(yīng)過程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積進行實時檢測，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析。2023/7/2128第28頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月PCRRealtimePCRS1S2M實時熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別2023/7/2129第29頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體）的發(fā)射光譜與另一基團（受體）的激發(fā)光譜有一定的重疊，當(dāng)兩個基團之間的距離足夠近（小于100?）時，以供體基團的激發(fā)波長進行激發(fā)，可獲得由受體基團發(fā)射的熒光。2023/7/2130第30頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月即：在供體基團的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導(dǎo)的能量直接轉(zhuǎn)移給了受體。在此過程中沒有光子的參與，是非輻射性的能量轉(zhuǎn)移過程，轉(zhuǎn)移效率與供體－受體兩個基團之間距離的6次冪倒數(shù)成正比例。2023/7/2131第31頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月FRET產(chǎn)生條件1.存在熒光供體和受體，而且供體的發(fā)色光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊常用的FRET組合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

2023/7/2132第32頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

2供體和受體的距離足夠近：1-10nm

（1－10nm為分子內(nèi)/間互作的距離：如蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變、酶催化反應(yīng)等。）

——超顯微觀察

3合適偶極方向

4足夠熒光壽命 無FRETFRETFRET產(chǎn)生條件2023/7/2133第33頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光域值線（fluorescencethresholdline）：背景熒光與熒光信號的分界值，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或經(jīng)驗來設(shè)定，常設(shè)定為初始3-7個循環(huán)熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念2023/7/2134第34頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月閾值2023/7/2135第35頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR擴增過程中，各反應(yīng)管的熒光信號與熒光域值線的交叉點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)（指數(shù)擴增的開始階段）。在實時熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念2023/7/2136第36頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月CT值熒光信號穿過閾值線時的循環(huán)次數(shù)2023/7/2137第37頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)值存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可對樣本中目標(biāo)基因的含量進行精確計算。初始模板濃度的確定2023/7/2138第38頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies2023/7/2139第39頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月用Ct值定量的意義實時熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。

2023/7/2140第40頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴增的擴增曲線圖

終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性

2023/7/2141第41頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月絕對定量成為可能靈敏度高：可檢測10–100個細胞中１個拷貝數(shù)量的基因低拷貝基因的檢測細小倍數(shù)差異樣品的檢測實時熒光定量PCR的優(yōu)勢2023/7/2142第42頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月線性范圍寬(6-9個數(shù)量級)，無需稀釋高濃度樣品可以在一次實驗中同時檢測定量高表達和低表達基因熒光探針使PCR產(chǎn)物檢測特異性進一步提高全封閉無PCR后處理*幾乎沒有污染機會實時熒光定量PCR的優(yōu)勢2023/7/2143第43頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

相對定量和絕對定量：相對定量指的是確定樣本中靶序列相對于另一參照樣本中靶序列量的變化值，絕對定量指的是確定樣本中靶序列的拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR的定量方法2023/7/2144第44頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月相對定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法比較Ct值法絕對定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法實時熒光定量PCR的定量方法2023/7/2145第45頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對量是未知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進行相對稀釋制成曲線，用以計算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的比值。相對定量方法2023/7/2146第46頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月比較Ct法:運用數(shù)學(xué)公式計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來計算起始模板的量。前提：靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致。相對定量方法2023/7/2147第47頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對量是已知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進行相對稀釋制成曲線，用以計算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列的絕對含量。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常用作絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來換算成其拷貝數(shù)。絕對定量方法2023/7/2148第48頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA結(jié)合染色：SYBRGreen1水解探針：TaqManMolecularBeacons熒光標(biāo)記引物雜交探針實時熒光定量PCR使用的熒光化學(xué)方法2023/7/2149第49頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenISYBRGreen12023/7/2150第50頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA2023/7/2151第51頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理2023/7/2152第52頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI工作原理2023/7/2153第53頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光強度Vs溫度熒光強度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI重新游離到溶液中Tm是熔解曲線的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲線分析2023/7/2154第54頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月以熒光值隨溫度變化作負(fù)導(dǎo)-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲線分析2023/7/2155第55頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreen熔解曲線分析

2023/7/2156第56頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜2023/7/2157第57頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計反應(yīng)體系的組成：傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系+SYBRGreenI1.SG濃度：終濃度1:5,000－1:100,000，一般為1:10,000—1:70,0002023/7/2158第58頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.Primer濃度：設(shè)計原則同普通PCR

終濃度50nM－300nM

固定模板濃度的梯度實驗不加模板的對照實驗（NTC）

——有無非特異信號SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計2023/7/2159第59頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

熔解曲線的分析——是否單峰

建議使用HPLC純化的引物3.MgCl2濃度

降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物

最低可至1.5nM同時做梯度實驗和NTC對照SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計2023/7/2160第60頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

4.反應(yīng)溫度和時間參數(shù)：反應(yīng)溫度參考所用酶的種類；退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化；反應(yīng)時間與常規(guī)PCR類似；擴增片斷一般為200－300bp。SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計2023/7/2161第61頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月不同讀板溫度對實驗結(jié)果的影響：80℃2023/7/2162第62頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月不同讀板溫度對實驗結(jié)果的影響：86℃2023/7/2163第63頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

SYBRGreenI的特點和不足不涉及特異的探針，方法設(shè)計簡單，特異性差；熒光強度依賴于體系中所有的dsDNA分子，不能區(qū)分引物二聚體、非特異性擴增片斷等；通過繪制溶解曲線可較好地保證特異性。

2023/7/2164第64頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)化的讀板溫度

-高于非特異產(chǎn)物的Tm值

-低于目標(biāo)產(chǎn)物的Tm值A(chǔ)mpliconNon-specificproducts熔解曲線分析的應(yīng)用2023/7/2165第65頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針2023/7/2166第66頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqMan目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補2023/7/2167第67頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理2023/7/2168第68頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計引物、探針設(shè)計原則：優(yōu)先選擇探針的序列；Tm值應(yīng)比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；長度不應(yīng)超過30堿基，18-30bp,optimal20；5’端不應(yīng)是G，G有可能會淬滅熒光素。

2023/7/2169第69頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計選擇合適的模板鏈，使探針的Cs>Gs；擴增片斷不超過400bp，通常為80－150bp。避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)，特別是四個或四個以上Gs連續(xù)出現(xiàn)；引物應(yīng)盡量靠近探針；引物的Tm值為59－60度，長度約20堿基；避免引物、探針之間的二級結(jié)構(gòu)。2023/7/2170第70頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月引物、探針濃度的優(yōu)化

目標(biāo)：最高的信號/背景比，最小的Ct值

引物濃度：50nM－900nM

探針濃度：50nM－250nM

通過多次實驗確定各自的濃度和比例Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計2023/7/2171第71頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman探針的不足采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記，淬滅難以徹底，本底較高；采用酶外切活性，受酶性能影響；探針標(biāo)記成本較高。改進：用不發(fā)光的淬滅熒光分子取代TAMRA2023/7/2172第72頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Molecular

BeaconsMolecularBeacons發(fā)夾型雜交探針2023/7/2173第73頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月MolecularBeacons莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對莖熒光素淬滅劑環(huán)2023/7/2174第74頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

2023/7/2175第75頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月MolecularBeacons特點和不足對目標(biāo)序列有很高的特異性；是用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一；采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低；不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性差；探針合成標(biāo)記較復(fù)雜。2023/7/2176第76頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站

1．引物/探針的設(shè)計

?

Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

?

GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

?

2023/7/2177第77頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

1．引物/探針的設(shè)計

?

FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

?

PerlPrimer(OwenMarshall)

/

?

PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站2023/7/2178第78頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月．2.反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR引物設(shè)計

?

ExonPrimer(TechnischeUniversit?t,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

?

AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特異性的驗證

?

Blast(NCBI) /BLAST/引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站2023/7/2179第79頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月

?

GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

?

OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

?

OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站2023/7/2180第80頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月5．?dāng)U增子二級結(jié)構(gòu)的評估

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探針設(shè)計和評估相關(guān)的免費網(wǎng)站2023/7/2181第81頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測；腫瘤研究；基因表達研究；免疫組份分析；基因突變及多態(tài)性的研究2023/7/2182第82頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測：檢測患者血清中肝炎病毒濃度為臨床藥物治療和療效觀察提供依據(jù)；檢測HIV的量預(yù)測發(fā)病時間；選擇治療藥物：干擾素對肝炎病毒高拷貝者不敏感，對低拷貝者敏感。2023/7/2183第83頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

腫瘤研究：癌基因及其相關(guān)基因的定量檢測可進行腫瘤的早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷；檢測治療中和治療后微量殘余惡性細胞存在的數(shù)量，作為治療效果和估計復(fù)發(fā)危險性的依據(jù)。2023/7/2184第84頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月基因差異表達研究標(biāo)準(zhǔn)曲線法

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定基因表達上的差異相對定量法(2－△△Ct法)

不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接分析得到基因差異表達的倍數(shù)關(guān)系2023/7/2185第85頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線法步驟：1.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測出目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比較不同樣品間目標(biāo)基因表達差異2023/7/2186第86頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月相對定量法前提目標(biāo)基因和看家基因的擴增效率一致，且接近100％。步驟通過實時熒光曲線得到目標(biāo)基因和看家基因的Ct值均一化校準(zhǔn)△Ct=Ct目標(biāo)基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同時間、不同組織)基因差異表達的倍數(shù)＝2－△△Ct2023/7/2187第87頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月基因突變及多態(tài)性-SNP檢測2023/7/2188第88頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月基因分型方法

使用TaqMan探針

(雙色法)溶解曲線

(單色法)序列特異PCR

(單色法)2023/7/2189第89頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探針進行基因型分析SNP檢測-基因型分析2023/7/2190第90頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析2023/7/2191第91頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月從病人血液樣品中提取DNA基因型分類：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析2023/7/2192第92頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Allele1controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析2023/7/2193第93頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月Allele2controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析2023/7/2194第94頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月HeterozygotecontrolFAMVIC多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析2023/7/2195第95頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月VICFAM2023/7/2196第96頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析2023/7/2197第97頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI進行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配會導(dǎo)致PCR效率上有大約1000倍的差異，由此導(dǎo)致產(chǎn)物積累會有10個cycles延遲

末端匹配與否，與反應(yīng)終產(chǎn)物量的多少沒有必然聯(lián)系

PCR#1PCR#22023/7/2198第98頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI進行SNP分析MatchMismatch2023/7/2199第99頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI進行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile2023/7/21100第100頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI進行基因分型Intensity-dI/dT2023/7/21101第101頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqMan?MicroRNA分析方法

加長靶基因的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR2023/7/21102第102頁，課件共113頁，創(chuàng)作于2023年2月miRNAs的研究

MicroRNAs是一種內(nèi)源性長度在２２個堿基左右的RNA分子，它在動植物中具有重要的基因調(diào)控作用，它們通過與mRNAs結(jié)合抑制翻譯或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各種生命體中發(fā)現(xiàn)的miRNAs類型共有約700種以上,通過實驗驗證或經(jīng)數(shù)據(jù)庫和軟件推測