基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討人參治療胃癌的作用機(jī)制

·162··162·引用:唐萍,唐芳婷,王紅,張靚,李躍軍.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討人參治療胃癌的作用機(jī)制[J].湖南中醫(yī)雜志,唐萍1,2,唐芳婷1,王紅1,張靚1,李躍軍1(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬省直中醫(yī)醫(yī)院,湖南株洲,412000;2.湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬第一醫(yī)院,湖南株洲,412000)[摘要]目的:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討人參治療胃癌的作用機(jī)制。方法:利用網(wǎng)絡(luò)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選人參有效成分、分子靶點(diǎn)及胃癌疾病靶點(diǎn)。采用Perl工具獲取藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因,生物信息學(xué)方法構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),篩選核心靶點(diǎn),并進(jìn)行生物學(xué)功能富集分析。應(yīng)用AutoDockVina軟件和Pymol對(duì)核心成分及蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接和結(jié)合能力預(yù)測(cè)。結(jié)果:獲得人參22種有效成分及98個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),篩選出人參治療胃癌的核心靶點(diǎn)3個(gè),包括轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)。基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析結(jié)果顯示,人參主要通過(guò)參與抗炎、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程治療胃癌。分子對(duì)接結(jié)果顯示,山柰酚與關(guān)鍵靶點(diǎn)JUN、MAPK8有強(qiáng)烈的結(jié)合能力。結(jié)論:人參通過(guò)抗炎、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程發(fā)揮多[關(guān)鍵詞]胃癌;人參;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接;作用機(jī)制1基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81703916);湖南省自然科學(xué)基金科衛(wèi)聯(lián)合項(xiàng)目(2018JJ6042)第一作者:唐萍,女,2020級(jí)碩士研究生,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤通信作者:李躍軍,男,副主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué),E-mail:liyuejun97@foxmail.com第6期唐萍,唐芳婷,王紅,等:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討人參治療胃癌的作用機(jī)制·163·胃癌是全球常見(jiàn)的癌癥死亡原因之一,而我國(guó)是全球胃癌發(fā)病率和病死率最高的國(guó)家[1]。目前綜合治療(MDT)模式,可取得一定的療效,但晚期胃癌的治療效果仍不理想[2]。因此,研究具有確切療效的治療胃癌的藥物,并闡述其作用機(jī)制是目前亟待解決的問(wèn)題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾胃虛弱是胃癌的基本病因病機(jī),現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)健脾益氣類(lèi)中藥可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力、減輕放化療的毒副作用、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、提高抗癌療效,并且延長(zhǎng)患者生存期[3]。人參可大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)虛扶正、寧身益智、益氣生津[4],研究證實(shí)人參可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)、影響腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)免疫等功能發(fā)揮抗胃癌的作用[5-6],人參聯(lián)合西醫(yī)治療胃癌的有效率明顯高于單用西醫(yī)治療,以人參為主的中藥方劑配合西醫(yī)治療方案,可以明顯改善營(yíng)養(yǎng),提高機(jī)體免疫功能,減輕毒副作用[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)及計(jì)算機(jī)軟件,構(gòu)建藥物成分、作用靶點(diǎn)、疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,與中醫(yī)學(xué)存在較多相似性[8]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,篩選人參的有效成分及人參治療胃癌的分子作用機(jī)制,利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證人參有效成分治療胃癌的有效性,為人參的相關(guān)新藥研發(fā)及胃癌治療提供參考。1.1人參的活性成分及其作用靶點(diǎn)的收集利用集人參的活性成分及其作用靶點(diǎn)。設(shè)置藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)口服生物利用度(OB)≥30%和(DL)≥0.18,篩選人參的活性成分及其相應(yīng)的作用org/)獲取人類(lèi)疾病中已發(fā)表的作用靶點(diǎn)的官方統(tǒng)本5.32.1.1)整合得到人參有效成分作用靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。1.2胃癌基因靶點(diǎn)的收集在療效藥靶數(shù)據(jù)庫(kù)遺傳藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.DrugBank)檢索獲取胃癌的基因及相關(guān)靶點(diǎn),利用R重復(fù)靶點(diǎn)后整理得到胃癌靶點(diǎn)合集。1.3人參活性成分-胃癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用Perl軟件獲取人參作用靶點(diǎn)與胃癌相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),這些重復(fù)靶點(diǎn)即為中藥人參治療胃癌的作用靶點(diǎn)。將人參活性成分及作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cyto-以構(gòu)建人參活性成分及其作用靶點(diǎn)間的“人參成分-胃癌靶點(diǎn)”多層關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.最低的交互作用閾值為0.9,物種被設(shè)置為“Homo sapiens”,其余的參數(shù)被留為默認(rèn)設(shè)置以得到蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)圖。將STRING分析得到的數(shù)據(jù)下載后性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)、局部邊連通性(LAC)6個(gè)主要拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)參數(shù)篩選后,得到人參治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn),并展示相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。·164··164·1.5關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)功能與通路分析首先在enrichplot等進(jìn)行富集分析。對(duì)于基因本體(GO)因組百科全書(shū)(KEGG)通路的富集分析,將organ-P值和q值閾值均設(shè)置為1,過(guò)濾條件:p-value<進(jìn)行GO功能富集分析,輸出前20條KEGG通路富集分析結(jié)果。1.6小分子受體與蛋白配體的準(zhǔn)備選取篩選出的核心靶蛋白作為核心受體蛋白,核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)有效成分作為配體,在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. 下載該核心靶點(diǎn)三維結(jié)構(gòu)的PDB格式,使用Pymol軟件(https://pymol.org/2/,版本2.5.2)對(duì)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白受體pdb文件去除水分子及原配體分子得到文件(命名為rep.pdb)。在PubChem數(shù)據(jù)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)有效成分的二維結(jié)構(gòu)的SDF格式,并用軟維SDF格式轉(zhuǎn)換為三維的PDB格式(命名為 設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵和活動(dòng)鍵時(shí)需要移動(dòng)的最少的原子數(shù)目后保存為lig.pdbqt格式。再將處理后的蛋白軟件中加電荷加氫,合并孤對(duì)電子,合并非極性氫,理后的受體和配體的pdbqt格式文件進(jìn)行分子對(duì)接,利用Pymol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析及可視化。篩選出22種人參化學(xué)成分(見(jiàn)表1),同時(shí)得到人參活性成分的潛在作用靶點(diǎn)98個(gè)。表1人參活性成分信息表活性成分因,利用R軟件去重整理后得到胃癌10890個(gè)靶基因。2.3人參活性成分-胃癌候選靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Perl軟件得到人參活性成分的靶點(diǎn)98個(gè),與胃癌疾病靶點(diǎn)10890個(gè)進(jìn)行比對(duì)并取交集,篩選出人參作用于胃癌的靶點(diǎn)84個(gè)。將22種人參藥物成分和84個(gè)胃癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)錄入Cytoscape軟件,構(gòu)建“人參藥物成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”(見(jiàn)圖1),該網(wǎng)絡(luò)有106個(gè)節(jié)點(diǎn)和179條邊,圖中紅色代表人參有效成分,線條的數(shù)量代表其作用的疾病靶點(diǎn);藍(lán)色代表作用靶點(diǎn),其大小表示作用于該靶點(diǎn)的藥物活性成分?jǐn)?shù)量。第6期唐萍,唐芳婷,王紅,等:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討人參治療胃癌的作用機(jī)制·165·圖1人參藥物成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2),將22種人參藥物成分和84個(gè)靶點(diǎn)蛋白的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cyto-scape3.8.0軟件,進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?再采用參數(shù)進(jìn)行2次核心靶點(diǎn)篩選后得到3個(gè)核心靶點(diǎn),包括轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)(見(jiàn)圖3、表2)。·166··166·圖3人參治療胃癌核心靶點(diǎn)篩選表2核心靶蛋白信息表869分析包括生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)和分子功能(MF)3個(gè)層面,各列出了前10條項(xiàng)目,見(jiàn)圖4。柱子的顏色由藍(lán)色至紅色表示P值由大到小,故紅色柱子越長(zhǎng)表明顯著性越高,作用越重要。相關(guān)的生物過(guò)程途徑主要包括對(duì)異物刺激的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源的分子反應(yīng)、對(duì)脂多糖反應(yīng)等,相關(guān)的細(xì)胞部位主要包括膜筏、膜微區(qū)、突觸后膜等,主要參與肽2.6關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)校正P值、Count值排序,繪制出前20條關(guān)鍵信號(hào)通路,節(jié)點(diǎn)的大小表示富集到該通路的靶點(diǎn)數(shù)目,節(jié)點(diǎn)越大表示靶點(diǎn)富集數(shù)目越多;節(jié)點(diǎn)的顏色由藍(lán)色至紅色表示P值由大到小,故紅色節(jié)點(diǎn)越大表明信號(hào)通路的顯著性越高,作用越重要。結(jié)果顯示,主要富集在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路、化學(xué)致癌作用-受體激活通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、腫瘤(IL-17)、Th17細(xì)胞分化、缺氧誘導(dǎo)因子-1抑制劑(HIF-1)、C型凝集素受體等信號(hào)通路,這些通路說(shuō)明人參可能是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥、免疫等多信號(hào)、多通路方式發(fā)揮抗胃癌作用。2.7分子對(duì)接結(jié)果分析本次選取核心靶蛋白的JUN、MAPK8作為小分子配體與對(duì)應(yīng)的活性成分山柰酚(kaempferol)分別進(jìn)行分子對(duì)接,以最低結(jié)合能作為靶蛋白和配體對(duì)接的結(jié)果,使用Pymol軟分析及可視化(見(jiàn)圖6)。若結(jié)合能<-5.0kcal/mol,表明靶蛋白與活性成分結(jié)合性好,且結(jié)合能越小表明兩者對(duì)接越好[9]。結(jié)果顯示,JUN與山柰酚證實(shí)人參核心靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分均對(duì)接良好。胃癌的發(fā)生主要是環(huán)境、宿主、幽門(mén)螺桿菌感染等多種因素共同作用的結(jié)果[10],中醫(yī)將胃癌歸屬脾胃虛弱是其基本病因病機(jī),在脾胃虧虛基礎(chǔ)上產(chǎn)生氣滯、血瘀、痰濕等病理變化,主張?jiān)谥委熯^(guò)程中使用健脾益氣的方法[11]。健脾補(bǔ)氣類(lèi)中藥已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于胃癌的臨床治療中,臨床應(yīng)用含人參的方劑輔助西醫(yī)治療胃癌的療效顯著優(yōu)于單獨(dú)的西醫(yī)治療模式[5],如六君子湯加減方治療胃癌術(shù)后脾虛[12]、柴芍六君子湯加減用于腹腔鏡胃癌手術(shù)康復(fù)[13]、益氣健脾方輔助FOLFOX4化療方案治療胃癌術(shù)后脾胃虛弱證[14]等。目前關(guān)于人參治療胃癌的藥理學(xué)研究尚不全面,人參有效成分如人參皂甙免疫功能、刺激腫瘤壞死因子α、γ干擾素等多種細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗胃癌作用[6-7,15-19]。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多成分的特點(diǎn),臨床證實(shí)人參可以有效治療胃癌,且與多種信號(hào)通路密切相關(guān),但其具體分子作用機(jī)制尚不全面。本研究通過(guò)對(duì)人參活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)山柰酚(kaempferol)是人參治療胃癌的關(guān)鍵有效成分。研究顯示,山柰酚可以通過(guò)肌醇酶1-C-Jun氨基末端激酶-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(IRE1-JNK-CHOP)途徑誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并抑制胃癌細(xì)胞中的G9a,發(fā)揮抗胃癌作用[20]。山柰酚還可以通過(guò)G2/M期、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)記物的下調(diào),以及磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路進(jìn)行細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯實(shí)現(xiàn)抗腫瘤[21]。由此可見(jiàn),以山柰酚為代表的有效成分在人參治療GC時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。第6期唐萍,唐芳婷,王紅,等:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討人參治療胃癌的作用機(jī)制·167··168··168·圖5KEGG通路富集分析氣泡圖柰酚。圖6人參活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接可視化在PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中,共篩選出人參治療胃癌的實(shí),JUN蛋白是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(AP-1)家族的成員,JUN過(guò)度表達(dá)誘發(fā)胃癌的癌變[22]。RELA蛋白是轉(zhuǎn)錄因子p65,是轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的表現(xiàn)形式之一,能夠啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄并引發(fā)腫瘤[23]。此外,RELA可通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等[24]。MAPK8蛋白過(guò)度激活在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起著重要作用[25]。綜上所述,這些靶點(diǎn)是人參對(duì)抗胃癌的核心靶點(diǎn),體現(xiàn)了人參可通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮治療胃癌的作用。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),人參的有效成分主要在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞膜部位發(fā)揮作用,影響細(xì)胞的肽結(jié)合、G蛋白-耦聯(lián)胺受體活性、核受體活性等分子性能,從而干預(yù)了胃癌細(xì)胞對(duì)外來(lái)刺激、細(xì)菌來(lái)源的分子、脂多糖的反應(yīng)達(dá)到治療胃癌的作用。通過(guò)KEGG通路富集分析結(jié)果,結(jié)合已有研究發(fā)現(xiàn),胃癌的發(fā)生發(fā)展與卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)感染、愛(ài)潑斯坦-Barr病毒(EBV)感染、TH-17細(xì)胞分化通路、TNF信號(hào)通路等多條信號(hào)通路相關(guān)。KSHV可以抑制干擾素的合成和抗病毒作用,抑制胃癌細(xì)胞凋亡,刺激胃癌的發(fā)生機(jī)生[27]。TH-17可上調(diào)凋亡相關(guān)分子和蛋白的表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[28]。TNF作為致癌因子,能夠與受體結(jié)合并調(diào)控炎性反應(yīng)、免疫、細(xì)胞凋亡或存活,參與胃癌發(fā)生、細(xì)胞增等多個(gè)病理過(guò)程[29]。因此,可以推斷人參有效成分可以調(diào)節(jié)多種和癌癥相關(guān)的信號(hào)通路,通過(guò)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力以及防止胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移來(lái)達(dá)到治療胃癌的目的。分子對(duì)接結(jié)果顯示,人參的核心成分山柰酚與和力。對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合能均<-5.0kcal/mol,二者結(jié)合構(gòu)像穩(wěn)定,證實(shí)人參的核心靶點(diǎn)與胃癌的核心靶點(diǎn)蛋白有強(qiáng)烈的結(jié)合能力,也進(jìn)一步驗(yàn)證了本第6期唐萍,唐芳婷,王紅,等:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討人參治療胃癌的作用機(jī)制·169·研究的預(yù)測(cè),人參可能通過(guò)多成分、多途徑作用于胃癌的多靶點(diǎn)從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示,RELA、MAPK8等84個(gè)靶點(diǎn),通過(guò)干預(yù)卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹(KSHV)病毒感染、EBV感染、IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等多條通路,參與抗炎、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生物過(guò)程發(fā)揮對(duì)胃癌的治療作用。本研究對(duì)人參治療胃癌的作用途徑及作用機(jī)制進(jìn)行了研究,證實(shí)人參是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮抗胃癌的療效,為后續(xù)深入研究提供了理論依據(jù)。然而,由于各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)錄入數(shù)據(jù)的主觀性,目前得到的關(guān)于人參治療胃癌的藥效物質(zhì)、作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制也會(huì)隨著相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善和研究方法的不斷進(jìn)步而發(fā)生變化。本次研究只通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證有效性,未能通過(guò)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證,以后仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探討及論證,為更深層次的挖掘人參藥物-疾病靶點(diǎn)相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[3]李云霞.益胃消癌湯治療脾虛痰瘀型胃癌療效及對(duì)免疫功能和血清LAG-3、DKK-1的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2020,29(9):962-967.[4]王月,翟華強(qiáng),魯利娜,等.人參的本草考證及現(xiàn)代研究綜述[J].[6]喬雪涵,岳麗玲,朱文斌.人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2021,37(10):1272-1276.[7]李現(xiàn)雷.中藥輔助營(yíng)養(yǎng)方案對(duì)胃癌術(shù)后患者營(yíng)養(yǎng)狀況與免疫功[8]解靜,高杉,李琳,等.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域中的研究進(jìn)展與應(yīng)用策略[J].中草藥,2019,50(10):2257-2265.[9]莊莉,翟園園,姚衛(wèi)峰,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的二至丸對(duì)腎臟保護(hù)作用的機(jī)制研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2019,54(5):877-885.