遺傳工程動(dòng)物

遺傳工程動(dòng)物第1頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月遺傳工程胚胎工程操作對(duì)象基因（基因工程）早期胚胎、配子技術(shù)手段獲取目的基因構(gòu)建表達(dá)載體目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因檢測(cè)與鑒定胚胎移植體外受精胚胎分割胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)理論基礎(chǔ)中心法則哺乳動(dòng)物受精卵早期胚胎發(fā)育規(guī)律第2頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月中心法則：

在細(xì)胞分裂過程中，遺傳信息通過DNA的復(fù)制傳遞給子代，在子代的個(gè)體發(fā)育過程中遺傳信息又從DNA傳遞到RNA，最后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，在某些病毒（如煙草花葉病毒等）中的RNA能夠自我復(fù)制，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)生物合成，某些病毒（如致癌病毒等）還能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA。第3頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因敲除動(dòng)物基因敲入動(dòng)物

根據(jù)外源基因在染色體上的整合情況，可將遺傳工程動(dòng)物分為以下幾類：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

染色體工程動(dòng)物第4頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

將特定的外源基因或經(jīng)過改造的自身基因成分通過各種技術(shù)手段導(dǎo)入動(dòng)物受精卵或胚胎內(nèi)，使之穩(wěn)定整合于動(dòng)物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物“特定的外源基因或經(jīng)過改造的自身基因成分”——目的基因“各種技術(shù)手段”——各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)第5頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個(gè)生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過程來(lái)實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的改造。第6頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.1974年，Jaenisch等人把純化的SV40病毒DNA注入小鼠囊胚腔后，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的許多組織中都有該基因序列，表明外源基因已整合于胚胎細(xì)胞的基因組中。

2.1980年，Gorden等進(jìn)一步完善了顯微操作技術(shù)，首次應(yīng)用顯微注射的方法，把克隆的人胸苷激酶基因注射到小鼠受精卵的雄性原核內(nèi)，建立了轉(zhuǎn)基因小鼠。3.1982年，Palmiter將大鼠生長(zhǎng)激素基因結(jié)構(gòu)區(qū)融合在SMT[金屬巰蛋白基因（MT）啟動(dòng)子]中，注射到小鼠受精卵雄性原核內(nèi)，獲得了體型似大鼠的轉(zhuǎn)基因巨型小鼠。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究發(fā)展概況第7頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.1985年，Smithies等建立了ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)，首先在β球蛋白位點(diǎn)上進(jìn)行基因打靶，獲得基因敲除小鼠。4.1987年，英國(guó)Roslin研究所研制成功α-抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊，乳汁中分泌α-抗胰蛋白酶含量高達(dá)30mg/L，標(biāo)志著利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)生物藥品在實(shí)踐上是可行的。5.1995年，Ramirez-Solis等用重組酶Cre/LoxP系統(tǒng)首先制作成功染色體重排小鼠。6.2000年，McCreath等用體細(xì)胞基因打靶技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因綿羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高達(dá)650ugml。第8頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

我國(guó)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究始于20世紀(jì)80年代初期，中國(guó)科學(xué)院率先成功地制作了人β-珠蛋白基因、大腸桿菌galk和gpt基因、牛及人生長(zhǎng)激素等多種轉(zhuǎn)基因小鼠，在轉(zhuǎn)基因豬、牛、羊和兔等的研究方面，也取得了成功，并在國(guó)際上首先將人生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)移到金魚受精卵中，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和具有抗性的魚類新品種開拓了新途徑。

1994年在上海、1995年在長(zhǎng)春、分別召開了兩屆全國(guó)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物學(xué)術(shù)討論會(huì)，2002年在上海召開了國(guó)際轉(zhuǎn)基因動(dòng)物學(xué)術(shù)討論會(huì)。目前，遺傳工程動(dòng)物、模式動(dòng)物疾病動(dòng)物模型的研究被列為國(guó)家“863”計(jì)劃的重點(diǎn)項(xiàng)目之一。第9頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2001年，國(guó)家科技部資助南京大學(xué)建立了“國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)”，專門用于研究開發(fā)、收集、保存和供應(yīng)遺傳工程小鼠，形成資源共享的公共服務(wù)平臺(tái)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的成熟和發(fā)展是在20世紀(jì)80年代以后，從國(guó)際上發(fā)表的論文數(shù)量來(lái)看，有關(guān)轉(zhuǎn)基因的論文呈直線上升，表明遺傳工程動(dòng)物研究已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。第10頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

乳動(dòng)物有大約30,000個(gè)基因，傳統(tǒng)基因功能研究方法如基因剔除和化學(xué)誘變等，技術(shù)要求高、時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用大，轉(zhuǎn)座因子是一類可以進(jìn)入基因組內(nèi)不同位置的基因載體，科學(xué)家利用它們插入基因，導(dǎo)致基因突變以了解基因功能，也利用它們培育轉(zhuǎn)基因生物。2005年，復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所的科研人員將一種源于飛蛾甘藍(lán)尺蠖中的DNA轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)piggyBac(PB)用于小鼠和人類細(xì)胞的基因功能研究，表明PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可作為一種新型實(shí)用的小鼠和其他脊椎動(dòng)物的高效遺傳操作工具，為大規(guī)模研究哺乳動(dòng)物基因功能提供了新方法。這是我國(guó)生命科學(xué)研究近年取得的重大成果之一。第11頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第12頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）獲取外源目的基因

從復(fù)雜的生物細(xì)胞基因組中，經(jīng)過酶切（限制性內(nèi)切酶）消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離得到帶有目的基因的外源性DNA片段。對(duì)于分子質(zhì)量較大而又不知其序列的基因，可從特定細(xì)胞里提取所需基因的mRNA后，借助逆(反)轉(zhuǎn)錄酶的作用合成堿基互補(bǔ)的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA?；蛘咄ㄟ^探明目的基因所含的遺傳密碼及其排列順序，然后用化學(xué)方法人工合成所需基因序列。第13頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是具有自體復(fù)制能力的一種環(huán)狀DNA分子，它經(jīng)過人工改造后能與外來(lái)基因連接，重新形成新的重組DNA分子，并帶有必要的標(biāo)記基因，用于攜帶目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。能在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA復(fù)制；在其DNA插入外源基因后，仍然保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性；易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化；在其DNA序列中，具有適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)。（二）構(gòu)建基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體第14頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

目前，常用的基因載體主要有兩大類型：一類是質(zhì)粒，另一類是病毒（如逆轉(zhuǎn)錄病毒）。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌中，可用溶菌酶分解細(xì)菌細(xì)胞壁，然后用物理化學(xué)方法，把質(zhì)粒與其他成分分開，從而得到純粹的質(zhì)粒，用于進(jìn)行體外重組DNA分子構(gòu)建的操作。第15頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）構(gòu)建重組DNA分子（重組外源目的基因）通過專一限制性內(nèi)切酶處理或人為方法，使帶有目的基因的外源DNA片段和能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記基因的載體DNA分子產(chǎn)生末端，并通過連接酶在體外使兩者連接起來(lái)，形成一個(gè)帶有目的基因的重組DNA分子?！凹舻杜c漿糊”——工具酶限制性核酸內(nèi)切酶

DNA連接酶末端轉(zhuǎn)移酶單鏈核酸酶反轉(zhuǎn)錄酶等

每一種酶都有自身特定的功能。有的像手術(shù)刀可以對(duì)DNA分子進(jìn)行定向進(jìn)行切割；有的像砌磚機(jī)，可以合成完整的雙鏈DNA分子。第16頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增用顯微注射等人工方法，將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使它能在細(xì)胞中“定居”下來(lái)，并與之一起增值。

(五)篩選與克隆、培育，獲得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物從大量的細(xì)胞群體中篩選出獲得重組DNA分子的受體細(xì)胞克??；從篩選出的受體細(xì)胞克隆中提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因；將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的物質(zhì)。第17頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月*1.顯微注射法：在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNA直接注入到受體的受精卵雄性原核內(nèi)。二、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法第18頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈的RNA病毒，能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，形成雙鏈的DNA原病毒，目前已成為基因轉(zhuǎn)移載體的最佳選擇，它可有效的整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。主要用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。第19頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.精子載體法：

將外源DNA與動(dòng)物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入受精卵內(nèi)。4.電穿孔法：

細(xì)胞暴露于高電壓時(shí)，細(xì)胞膜為高電壓瞬時(shí)擊穿，從而使外源DNA被攝入細(xì)胞中。5.脂質(zhì)體法：

將外源DNA裝入脂質(zhì)體（一種人造膜）與培養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，即可將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。6基因槍法：7.DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法：8.磷酸鈣介導(dǎo)法：

第20頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

超數(shù)排卵、取受精卵向受精卵雄性原核注入外源性DNA溶液，將細(xì)胞胚胎移植到假孕雌鼠的輸卵管中。

××正常雄鼠雌鼠A

結(jié)扎輸精管的雄鼠（品系不限)雌鼠B假孕雌鼠（ICR或KM）（選擇C57BL/6或BD62F1）二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作實(shí)例—轉(zhuǎn)基因小鼠（顯微注射法）第21頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

用結(jié)扎了輸精管的雄性小鼠與發(fā)情期的雌性小鼠進(jìn)行交配，雖然不能受精，但可以刺激子宮頸管，使雌性小鼠體內(nèi)的黃體活化，造成能繼續(xù)妊娠的內(nèi)分泌環(huán)境，這種小鼠稱為假孕雌鼠。假孕雌鼠一般采用遠(yuǎn)交系，如ICR或昆明種等，因其母性好，善帶仔鼠；體重最好大于25克。體型較大，便于移植。已產(chǎn)過仔并成功撫育過幼鼠的作假孕雌鼠最理想。第22頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生物制藥中的應(yīng)用：作為基因藥物的“生物反應(yīng)器”，生產(chǎn)具有醫(yī)藥價(jià)值的生物活性蛋白質(zhì)藥物：將抗凝血酶Ⅲ、人血清白蛋白、B一干擾素、降鈣素、胰島素、人生長(zhǎng)激素等的基因通過基因打靶技術(shù)，定點(diǎn)轉(zhuǎn)入?；蜓虻娜榍虻鞍踪|(zhì)基因中，在乳腺中高效表達(dá)，便可自乳汁中回收該蛋白質(zhì)。目前已從轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)出的治療蛋白主要有：奶山羊乳汁中高度表達(dá)的抗凝血酶Ⅲ和Or--1一蛋白酶抑制因子，綿羊乳汁中表達(dá)的OL--1一抗胰蛋白酶和人凝血因子Ⅸ，牛乳中表達(dá)的a-乳蛋白和乳鐵蛋白,兔乳中表達(dá)的a-葡萄糖苷酶等。第二節(jié)遺傳工程技術(shù)的應(yīng)用第23頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在人類疾病研究中的應(yīng)用：1.建立診斷和治療人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型人類的許多疾病都與遺傳因素相關(guān)。但人類倫理道德一般不允許直接對(duì)人的受精卵進(jìn)行基因操作，因而只有將處理過的體細(xì)胞移植到遺傳病患者體內(nèi)。但這種操作具有一定的危險(xiǎn)性，必須首先在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。所以，通過培育缺陷性狀矯正的動(dòng)物新品系，可以為這類疾病的基因治療提供寶貴的經(jīng)驗(yàn)和動(dòng)物模型。迄今為止，這方面的研究已取得了不少進(jìn)展。第24頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.生產(chǎn)可用于人體器官移植的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不僅可以用來(lái)摸索基因療法的經(jīng)驗(yàn)，而且還可能為因患病而導(dǎo)致某個(gè)器官功能衰退的病人提供健康的器官，如心、肝、腎等。

英國(guó)劍橋的幾位科學(xué)家為一只豬胚胎導(dǎo)入了人的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的轉(zhuǎn)基因豬，在世界上引起強(qiáng)烈反響，目前，這種轉(zhuǎn)基因豬已發(fā)展到數(shù)百頭。科學(xué)家的目的是希望這種轉(zhuǎn)基因豬能為人類提供健康的器官?，F(xiàn)在，他們已在進(jìn)行把轉(zhuǎn)基因豬的器官移植到靈長(zhǎng)目動(dòng)物身上的試驗(yàn)，預(yù)計(jì)移入人體的試驗(yàn)將在本世紀(jì)末得以實(shí)施。如果這項(xiàng)計(jì)劃能夠成功的話，那么將解決人類備用器官的缺乏，使千百萬(wàn)名患者脫離死亡。第25頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

除了開展異種器官移植研究之外，異種細(xì)胞移植的研究也在進(jìn)行中。已知很多疑難疾病、生理功能紊亂都與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞功能異常有關(guān)，但到目前為止，人類細(xì)胞還不能很好地傳代培養(yǎng)，因此將異種細(xì)胞尤其是豬的細(xì)胞移植到合適的位點(diǎn)，將使人類實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療成為可能。

1994年，Groth等將豬的胰島細(xì)胞移植給糖尿病病人，取得了一定的成效。

1997年,Deacon等將豬胎兒神經(jīng)細(xì)胞移植到患有帕金森疾病的病人大腦中，研究發(fā)現(xiàn)移植后的細(xì)胞能長(zhǎng)久保持活力。第26頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于基因治療

將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，達(dá)到治療目的。目前的基因療法是先從患者身上取出一些細(xì)胞，然后利用對(duì)人體無(wú)害的逆轉(zhuǎn)錄病毒當(dāng)載體，把正常的基因嫁接到病毒上，再用這些病毒去感染取出的人體細(xì)胞，讓它們把正常基因插進(jìn)細(xì)胞的染色體中，使人體細(xì)胞就可以“獲得”正常的基因，以取代原有的異?；?。第27頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

基因療法的典型例子是半乳糖血癥病人的基因治療。這種病人由于細(xì)胞內(nèi)缺少基因G，不能產(chǎn)生半乳糖—1—磷酸—尿苷酰轉(zhuǎn)換酶，以致大量半乳糖—1—磷酸和半乳糖堆積在肝組織中，這些半乳糖可轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭蚨斐筛闻K損害。為了治愈這種病人，人們把大腸桿菌(一般內(nèi)含G基因)能產(chǎn)生半乳糖酶的脫氧核糖核酸片段提取出來(lái)，讓噬菌體作為運(yùn)載體帶入病人的細(xì)胞內(nèi)，病人細(xì)胞便開始產(chǎn)生半乳糖酶。這樣，原來(lái)不能利用半乳糠的細(xì)胞便恢復(fù)了對(duì)半乳糖的正常代謝。如果這種已經(jīng)治愈的細(xì)胞用人工的方法移植到人體器官內(nèi)，使之成為人體的正常部分，那么這種病就從根本上治愈了。而且由于病人細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸的缺陷部分得了糾正，這種病也就不會(huì)再遺傳給下一代了。第28頁(yè)，課件共31頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)成功的基因治