第11講-動(dòng)物細(xì)胞生物制藥應(yīng)用-課件

第11講動(dòng)物細(xì)胞生物制藥應(yīng)用1ppt課件新民周刊

2010,5.17-23.P76-9

2010.11.2：世界肺炎日（第2個(gè)）全球每年約有160萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌疾病，平均每38秒就有1名5歲下兒童死于此病，1100萬(wàn)兒童因肺炎住院。導(dǎo)致兒童死亡的頭號(hào)殺手，并高致殘：智力低下、癲癇（17%）、耳聾（27.7%）。中國(guó)是10個(gè)肺炎發(fā)病率最高的國(guó)家之一，1/4兒童攜帶病菌；死亡兒童該病占46.8%。占西太平洋區(qū)的70%。紅霉素不敏感幾乎達(dá)到100%，青霉素達(dá)86%。1983年23價(jià)肺炎鏈球菌夾膜多糖疫苗PPV23誕生。2000年針對(duì)2歲以下兒童的7價(jià)肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合疫苗PPV7問(wèn)世。目前已經(jīng)接種3億劑，世界第一大單個(gè)疫苗。肺炎鏈球菌發(fā)現(xiàn)100年后，真正安全有效的PPV7疫苗才大規(guī)模使用。制造工藝非常復(fù)雜，約需要一年左右。只有愛(ài)爾蘭、美國(guó)兩家工廠。2ppt課件病毒及病毒疾病

甲型H1N1流感病毒豬流感（SwineFlu），是豬群中發(fā)現(xiàn)的一種可引起地方性流行性感冒的正黏液病毒，屬呼吸系統(tǒng)疾病，由甲型流感病毒(A型流感病毒)引發(fā)。以往曾經(jīng)發(fā)生人類感染豬流感，但未有發(fā)生人傳人案例。2009年4月墨西哥豬流感造成數(shù)150多死亡事件，并在多個(gè)國(guó)家蔓延。3ppt課件H、N的意思世界衛(wèi)生組織2009年4月30日建議使用“A/H1N1流感”的名稱。病毒根據(jù)抗原性的不同，可分為A、B、C三型。根據(jù)血凝素(Hemagglutinin，H)和神經(jīng)氨酸酶(Neyramidinase，N)的抗原特性，將A型流感病毒分成不同的亞型。目前，有15種特異的H亞型和9種特異的N亞型。病毒進(jìn)入細(xì)胞：血凝素（H）能和細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合，在細(xì)胞上打開(kāi)一個(gè)通道，使得病毒能進(jìn)入細(xì)胞。病毒要鉆出宿主細(xì)胞：神經(jīng)氨酸酶（N）通過(guò)“水解”的方式切斷病毒和宿主細(xì)胞的最后聯(lián)系，使病毒脫離宿主細(xì)胞。4ppt課件首批36萬(wàn)支甲型H1N1流感病毒疫苗抵達(dá)新疆

2009-10-165ppt課件SARS病毒SARS病毒屬于冠狀病毒科，病毒粒子多呈圓形，有囊膜，外周有冠狀排列的纖突，病毒直徑在80-120nm之間。感染病毒的細(xì)胞線粒體腫脹，部分線粒體外膜或嵴溶解，病毒顆粒主要分布在胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池、胞漿空泡內(nèi)和細(xì)胞外，多聚集成堆。6ppt課件HIV病毒-艾滋病HIV是艾滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus）的縮寫(xiě)?！叭祟惷庖呷毕莶《尽?。逆轉(zhuǎn)錄病毒，遺傳信息存在于兩個(gè)相同的RNA單鏈模板中。艾滋病是1981年發(fā)現(xiàn)的。生存于人的血液中并攻擊人體免疫系統(tǒng)。把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T4淋巴細(xì)胞作為攻擊目標(biāo)，大量吞噬、破壞T4淋巴細(xì)胞，從而使整個(gè)人體免疫系統(tǒng)遭到破壞，最終人體喪失對(duì)各種疾病的抵抗能力而導(dǎo)致死亡。7ppt課件2009年12月3日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在監(jiān)督檢查中發(fā)現(xiàn)，江蘇延申和河北福爾生物制藥股份有限公司的7個(gè)批次人用狂犬病疫苗存在質(zhì)量問(wèn)題。8ppt課件2010.3.17：山西疫苗事件9ppt課件本節(jié)主要內(nèi)容1.雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體2.病毒疫苗生產(chǎn)10ppt課件本節(jié)關(guān)鍵問(wèn)題雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體的制備原理與技術(shù)流程11ppt課件一雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體12ppt課件問(wèn)題回顧：什么是細(xì)胞融合？有什么優(yōu)點(diǎn)或作用？細(xì)胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。體細(xì)胞雜交：克服有性不親和性，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組，在育種方面意義重大。雜交瘤細(xì)胞：具有兩親本特性，生物制藥。13ppt課件基礎(chǔ)知識(shí)回顧（一）免疫學(xué)基礎(chǔ)1抗原進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細(xì)菌、各種細(xì)胞等。特點(diǎn)：外源性、結(jié)構(gòu)性（分子表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團(tuán)作為識(shí)別位點(diǎn)）、特異性（抗原與抗體的反應(yīng)）。14ppt課件2抗體動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的物質(zhì)，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）?；パa(bǔ)性決定區(qū)（Complementaritydeterminingregion，CDR）VH和VL的三個(gè)高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位（Antigen-bindingsite）。該部位形成一個(gè)與抗原決定簇互補(bǔ)的表面，決定抗體的多樣性與特異性。15ppt課件抗體產(chǎn)生的途徑免疫系統(tǒng)：包括體液免疫和細(xì)胞免疫，參與的細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞——發(fā)育成漿細(xì)胞，分泌抗體，參與體液免疫，脾臟可以分泌。T淋巴細(xì)胞——發(fā)育成吞噬細(xì)胞，直接參與細(xì)胞免疫，經(jīng)胸腺分泌。不能產(chǎn)生抗體，幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。16ppt課件多克隆抗體與單克隆抗體動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)個(gè)B淋巴細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)克隆，它針對(duì)抗原上的一個(gè)抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對(duì)不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。17ppt課件18ppt課件問(wèn)題的引出血液得到的只能是混合抗體，但是需要大量的僅針對(duì)某一個(gè)抗原決定族的單克隆抗體，幾乎是不可能的，因此必須采用其他方法。如果我們能分離得到只分泌某一種特異性抗體的B淋巴細(xì)胞，不就可以大量生產(chǎn)相關(guān)單抗了嗎？問(wèn)題：可以實(shí)現(xiàn)嗎？有什么技術(shù)限制嗎？很難離體培養(yǎng)B淋巴細(xì)胞。19ppt課件（一）歷史發(fā)現(xiàn)1975年，英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無(wú)限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。20ppt課件（二）雜交瘤技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長(zhǎng)期繁殖的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)（hydridomatechnique）。21ppt課件（三）單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域單克隆抗體的特點(diǎn)是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域：1.作為親合層析的配體2.作為生物治療的導(dǎo)向武器3.作為免疫抑制劑4.探針5.增強(qiáng)抗原的免疫原性6.作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑22ppt課件（三）技術(shù)流程視頻：/v_show/id_XMTY1ODg5MDI0.html23ppt課件親本細(xì)胞的準(zhǔn)備

細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選可分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)單克隆抗體的生產(chǎn)和純化24ppt課件1.動(dòng)物免疫與免疫脾細(xì)胞懸液的制備一般要經(jīng)過(guò)初次免疫、第二次免疫（向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射抗體）、加強(qiáng)免疫（向動(dòng)物靜脈內(nèi)注射抗體）三個(gè)過(guò)程。如果需要免疫脾細(xì)胞，一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液。25ppt課件免疫方法：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對(duì)細(xì)胞或微生物抗原可直接注射入小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動(dòng)物體內(nèi)。3－4天后，在無(wú)菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95％以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個(gè)/ml，加適當(dāng)濃度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。26ppt課件B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備注入小鼠皮下或腹腔取出脾臟B淋巴細(xì)胞

親本細(xì)胞的準(zhǔn)備27ppt課件2.骨髓瘤細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可利用一般的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液。小牛血清的濃度一般在10％—20％，細(xì)胞的最大密度不得超106個(gè)／ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1：10稀釋傳代，每3-5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為16-20h。通常采用HPRT（次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）與TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞系。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。28ppt課件3.細(xì)胞融合（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。（2）將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。29ppt課件（3）30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。（4）離心，棄上清，用20％小牛血清等輕輕混懸。將融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。30ppt課件4融合細(xì)胞的篩選

融合后的細(xì)胞類型融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無(wú)需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。剩余：脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞+未融合的瘤細(xì)胞+融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞，其中后兩種需進(jìn)行特別的篩選去除。31ppt課件HAT培養(yǎng)基篩選法培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。32ppt課件篩選原理33ppt課件34ppt課件35ppt課件5.克隆化培養(yǎng)將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)一段時(shí)間后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞。找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。36ppt課件6.分泌抗體的融合細(xì)胞的篩選酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）EILSA主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。37ppt課件7.單克隆抗體的大量生產(chǎn)（1）實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。采血量有限。38ppt課件（2）腹水制備法腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5～20mg/ml，這是目前最常用的方法。39ppt課件（3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)液離心除去細(xì)胞，收集上清液提取抗體。40ppt課件（五）人源化單克隆抗體簡(jiǎn)介鼠源性單抗仍帶有鼠抗原決定簇而使其應(yīng)用存在一定的局限性:（1）不能有效地激活人體中補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)（2）被人體免疫系統(tǒng)所識(shí)別,產(chǎn)生人抗鼠抗體(Humanantigenmouseantibody,HAMA)（3）在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除掉。通過(guò)人源化改造獲得低免疫原性、高效性、人源性單克隆抗體，解決鼠雜交瘤單抗用于人體的變態(tài)反應(yīng)的問(wèn)題。41ppt課件人—鼠雜交瘤：融合方法基本與鼠—鼠雜交瘤相同。親本骨髓瘤細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞，親本B細(xì)胞則來(lái)源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但是，人—鼠雜交瘤的人單克隆抗體分泌性能很不穩(wěn)定，多數(shù)情況下雜交瘤會(huì)很快失去抗體分泌能力。人—人雜交瘤：可通過(guò)建立人骨髓瘤或其他人細(xì)胞系與人淋巴細(xì)胞融合來(lái)制備人單克隆抗體。人源性融合親本細(xì)胞需具有較高的融合率、產(chǎn)生的雜交瘤核型穩(wěn)定并能產(chǎn)生一定量的具有特異性的抗體等特征。人—人雜交瘤核型穩(wěn)定，然而遺憾的是可供利用的人類骨髓瘤細(xì)胞種類非常有限。42ppt課件主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細(xì)胞株作為融合親本。現(xiàn)有的細(xì)胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細(xì)胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細(xì)胞十分困難，因?yàn)閷?duì)人來(lái)說(shuō)，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細(xì)胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細(xì)胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過(guò)小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水達(dá)到這一目的，但是人雜交瘤細(xì)胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。43ppt課件（六）文獻(xiàn)討論44ppt課件45ppt課件異丙基硫代半乳糖苷46ppt課件47ppt課件48ppt課件49ppt課件50ppt課件51ppt課件52ppt課件53ppt課件二病毒疫苗54ppt課件滅活疫苗：通過(guò)化學(xué)、物理或簡(jiǎn)單加熱的方法使病毒失去在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)復(fù)制的能力，但仍保留了病毒的免疫原性，接種人體后能產(chǎn)生對(duì)此病毒的抵抗力，這種將病毒殺滅后制備的疫苗被稱為滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，滅活病毒核酸而不影響其抗原性。例如：流行性乙型腦炎疫苗、狂犬病疫苗、流感滅活疫苗。減毒活疫苗：采用自然法或人工法通過(guò)動(dòng)物傳代或細(xì)胞傳代篩選對(duì)人毒性低的變異株病毒。常見(jiàn)的有脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯(lián)合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗）。55ppt課件病毒滅活疫苗病毒需要在敏感細(xì)胞中才能增殖。通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)繁殖病毒。大致步驟：1.找到病毒敏感細(xì)胞2.進(jìn)行病毒的分離3.病毒生產(chǎn)4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)5.I、II、III期臨床實(shí)驗(yàn)6.滅活疫苗制品56ppt課件病毒生產(chǎn)方法1.動(dòng)物接種：例如狂犬病毒，采用鼠、兔腦內(nèi)接種后收取腦組織制成懸液。2.雞胚、鴨胚接種：如馬腦炎病毒采用10D齡雞胚接種，收獲全胚體液。3.細(xì)胞培養(yǎng)法：不同的病毒采用相應(yīng)的敏感細(xì)胞，接種一定量的病毒，培養(yǎng)一段時(shí)間，凍融細(xì)胞，離心收獲上清。57ppt課件一般流程：

流行性乙型腦炎病毒滅活疫苗制備工藝地鼠腎——剪碎，胰酶消化——地鼠腎細(xì)胞懸浮液——培養(yǎng)——接種病毒感染細(xì)胞——培養(yǎng)2-3天收獲病毒液——甲醛滅活（22℃，8天）——滅活病毒液——安全及效力實(shí)驗(yàn)——半成品——分裝——成品58ppt課件文獻(xiàn)討論狂犬病毒（RabiesVirus）疫苗生產(chǎn)59ppt課件狂犬病是由狂犬病毒（RabiesVirus）

引起的人畜共患的傳染病狂犬病毒屬于彈狀病毒科彈狀病毒屬。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對(duì)稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈RNA。是引起狂犬病的病原體。人被患狂犬病的動(dòng)物咬傷、抓傷或經(jīng)粘膜感染均可引起狂犬病。感染者發(fā)病時(shí)呈高度興奮狀態(tài)，并伴有發(fā)熱、頭痛、恐怖不安、驚風(fēng)怕聲、肢體發(fā)麻、吞咽困難，一旦喝水即引起嚴(yán)重痙攣等癥狀，出現(xiàn)恐水現(xiàn)象，故又稱“恐水癥”（hydrophobia）。60ppt課件61ppt課件62ppt課件.hk/search?q=%E4%B8%99%E5%86%85%E9%85%AF&btnG=%E6%90%9C%E7%B4%A2&hl=zh-CN&source=hp&aq=f&aqi=&aql=&oq=63ppt課件64ppt課件三動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)相關(guān)藥物65ppt課件干擾素（Interferon，IFN）是一種細(xì)胞因子，是真核細(xì)胞對(duì)各種刺激反應(yīng)后形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白）。生理作用主要有：（1）廣譜的抗病毒作用；（2）抑制某些細(xì)胞的生長(zhǎng)，例如：抑制成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞的增殖；（3）免疫調(diào)節(jié)作用；（4）抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞。天然干擾素主要用人白細(xì)胞、類淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞誘生，提取和純化后獲得。66ppt課件類淋巴細(xì)胞干擾素制備1975年，美國(guó)的斯爵德（Strander）等發(fā)現(xiàn)Namalva細(xì)胞（Burkitt淋巴瘤）具有高效的干擾素誘生能力。培養(yǎng)基用RPMI1640加3%（v/v）小牛血清和0.75%的（w/v）的Primatone(一種動(dòng)物組織的可溶性消化物)。待細(xì)胞密度達(dá)106/mL細(xì)胞濃度時(shí)開(kāi)始進(jìn)行干擾素誘生。鹽酸酸化至pH2.0，4℃存放，仙臺(tái)病毒滅活2天、NDV-F病毒滅活5天。氫氧化鈉中和至pH7.0得到類淋巴細(xì)胞干擾素粗品。干擾素粗品的純化采用3%三氯醋酸沉淀,去除上清，沉淀溶于0.1m磷酸鉀緩沖液中（pH8.0）（內(nèi)含0.5%TritonX-100），用ACA54柱超濾膠分離，再經(jīng)三氯醋酸沉淀后去上清，沉淀溶于磷酸緩沖液（pH8.0）中，回收率可達(dá)80%。分裝-20℃凍存，純度為2×108IU/mg蛋白。67ppt課件補(bǔ)充文獻(xiàn)（課后閱讀）PAI-1（I型纖溶酶原激活物抑制劑）、tPA（組織型纖溶酶原激活劑）是血漿纖溶活性的重要調(diào)節(jié)因子68ppt課件四動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)藥物存在問(wèn)題與發(fā)展方向（1）細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低。（2）大規(guī)模、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能力易丟失，或產(chǎn)物活性易降低。（3）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。因此大多僅能在小規(guī)模范圍內(nèi)研究，難以轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。（4）目前對(duì)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究比較欠缺。（5）在線監(jiān)測(cè)水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)。69ppt課件今后應(yīng)重點(diǎn)開(kāi)展的工作

（1）細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程代謝和產(chǎn)物形成機(jī)制等方面的理論研究。（2）開(kāi)發(fā)能高密度生長(zhǎng)、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。（3）開(kāi)發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)性能優(yōu)良、細(xì)胞解離容易，并能重復(fù)使用的新型廉價(jià)的微載體。（4）研制高效的培養(yǎng)模式與系統(tǒng)，包括新型的無(wú)菌生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進(jìn)的在線檢測(cè)、分析與自動(dòng)控制技術(shù)等。（5）基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研究。70ppt課件本節(jié)回顧單克隆抗體病毒疫苗動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要是提供一個(gè)載體增殖的支撐技術(shù)，需要其他技術(shù)配合，才能高效制備相關(guān)產(chǎn)品71ppt課件思考題1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？

提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動(dòng)物細(xì)胞融合是兩個(gè)體細(xì)胞直接融合。72ppt課件2.制備單克隆抗體時(shí)，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？提示：哺乳動(dòng)物感染抗原后，其體內(nèi)會(huì)形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋