第二次討論第一題

第二次討論第一題第1頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月PP寶藏T蛋白質(zhì)雙向電泳原理蛋白質(zhì)雙向電泳方法蛋白質(zhì)雙向電泳在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用Westernblot第3頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

即蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗)。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。westernblot第4頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月為更清楚地講清采用蛋白質(zhì)印跡法，下面我們通過一個實驗（用蛋白質(zhì)印跡法分析小鼠肝，腎兩個器官中的CYP1A1（細(xì)胞色素的一種）的含量。）來為大家介紹蛋白質(zhì)印跡法的應(yīng)用主要在于蛋白質(zhì)檢測第5頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月小鼠禁食過夜，斷頭處死，迅速剖開腹腔，取出肝、腎分別稱重↓按1g組織中加入冰預(yù)冷的10ml裂解液，10mMPMSF（苯甲基磺酰氟）1ml冰上制成10％的組織勻漿↓取1ml勻漿，4℃、離心30分鐘↓小心吸取上清液↓取少量上清液進(jìn)行蛋白定量，余下的-20℃保存?zhèn)溆米⒁馐马?樣品裂解或勻漿處理不徹底，以及蛋白質(zhì)沉淀不完全，，可能導(dǎo)致得率過低1.樣品制備第6頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月考馬斯亮藍(lán)G—250是一種蛋白質(zhì)染料，最大吸收峰在465nm,當(dāng)它與蛋白質(zhì)以范德華力結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G—250蛋白質(zhì)復(fù)合物，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm，其吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。按下表操作。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算測定管的濃度2.蛋白質(zhì)定量（考馬斯亮藍(lán)染色法）第7頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月裝配好制膠玻璃板↓按下列配方配制12％的分離膠：將表中的前四項組分混勻后，再加入APS和TEMED（四甲基乙二胺）?！龑⑸鲜鋈芤壕徛⑷胫颇z玻璃片至梳齒下1cm,操作中注意防止產(chǎn)生氣泡，聚膠30分鐘后用ddH2O完全洗凈封閉液?！?.制膠第8頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月制膠所用儀器第9頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月按下列配方配制5％的聚集膠：將表中的前四項組分混勻后，再加入APS和TEMED?！⑷刖奂z前，用濾紙吸干分離膠上的水。緩慢注入聚集膠，過程中注意防止產(chǎn)生氣泡。插入梳齒，聚膠30分鐘后小心拔除梳齒。↓用ddH2O清洗梳孔，放入電泳槽備用。第10頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月用SampleBuffer按1：1稀釋樣品↓95℃加熱變性5分鐘5.上樣及電泳將電泳槽內(nèi)注滿1×電泳緩沖液，徹底除去點樣孔中和膠底的氣泡?！齼蛇吙瞻椎挠镜傈c上等量的SampleBuffer，上樣量（20μl含40μg蛋白）↓向電泳外槽內(nèi)注入1×電泳緩沖液，蓋上蓋子，電泳開始時電壓為80V，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到120V，穩(wěn)壓，當(dāng)染料抵達(dá)分離膠底部約80分鐘，斷開電源4.樣品處理

第11頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月上樣示意圖以及注意事項第12頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月剪6塊濾紙和一塊NC膜，其大小與膠相同↓將濾紙預(yù)先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘，除去氣泡↓凝膠電泳完成后取出。按照海綿→3塊濾紙→凝膠→NC膜→另外3塊濾紙→海綿的順序依次放，應(yīng)避免氣泡↓用塑料支架夾緊上述各層，放入轉(zhuǎn)移內(nèi)槽及外槽，注入冰預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。注意NC膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負(fù)極↓轉(zhuǎn)移200mA穩(wěn)流，4℃，1.5小時（時間根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量而定）6.轉(zhuǎn)膜第13頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)移完成后，取出膜放在濾紙上，用鉛筆標(biāo)好正面，室溫干燥數(shù)分鐘↓用westernblotting封閉液封閉NC膜，室溫下振蕩1小時后4℃過夜（NC膜正面向上）8.一抗結(jié)合一抗用封閉液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(β-actin)配制）↓室溫振搖2小時（NC膜正面向上）↓以TBS-T洗膜3次，每次5-10分鐘注意事項，一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。7.封閉NC膜第14頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月二抗以TBS-T稀釋（按1：600配制）↓室溫振搖孵育1.5小時（NC膜正面向上）↓以TBS-T洗膜3次，每次5-10分鐘10.顯色：辣根過氧化物酶顯色(1)在試管中先加入1ml×HRP反應(yīng)緩沖液，然后依次加入試劑A500μl、試劑B500μl、C500μl混勻即可。(2)配制好的溶液應(yīng)避光存放，30min內(nèi)使用，染色為褐色。(3)室溫下染色時間為5～30min，可根據(jù)顏色變化掌握染色時間。(4)等目的條帶顯色后，用少量PBS清洗。注意事項，顯色液必須新鮮配置使用11.照相保存（另有化學(xué)發(fā)光，顯影，定影凝膠圖像分析等處理方法）9.二抗結(jié)合第15頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)雙向電泳的原理第16頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)雙向電泳

是等電聚焦電泳和SDS（聚丙烯酰氨凝膠電泳）的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS（按照分子大?。?jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。第17頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

等電聚焦電泳

等電點聚焦（IEF）是在電場中分離蛋白質(zhì)技術(shù)的一個重要發(fā)展。等電聚焦是在穩(wěn)定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方法。

這些分子總會是處于不斷擴(kuò)散和抗擴(kuò)散的平衡中，在pI處得以“聚焦”.第18頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月等電聚焦電泳原理蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。第19頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運(yùn)動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。等電聚焦電泳原理第20頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

聚丙烯酰氨凝膠電泳

作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native）及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）；非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。第21頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)雙向電泳的方法第22頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2D/MS經(jīng)典工作流程細(xì)胞裂解勻漿除雜質(zhì)濃縮定量差異分析雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光

蛋白標(biāo)記樣品制備分離染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞第23頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品制備細(xì)胞破碎蛋白沉淀溶解抑制蛋白酶活性去除 核酸 脂類 鹽，緩沖液，離子性小分子 不溶性物質(zhì)第24頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光蛋白標(biāo)記染色圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞Separation雙向電泳第一向第二向細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備第25頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)雙向電泳：傳統(tǒng)方法sample膠在SDS緩沖液中平衡PrincipleaccordingtoP.H.O’FarrellandJ.Klose(1975)pH10pH10pH3pH3垂直膠管中進(jìn)行等電聚焦urea,NP-40一向:二向:SDS丙烯酰胺凝膠電泳非連續(xù)梯度膠按等電點分離（電荷）按分子量分離（質(zhì)量）第26頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月使用載體兩性電解質(zhì)IEF時存在的問題不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定蛋白載量有限重現(xiàn)性差導(dǎo)致梯度漂移梯度漂移導(dǎo)致酸性和堿性蛋白質(zhì)丟失管膠柔軟，尺寸不定操作者個人技術(shù)影響結(jié)果第27頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月固相凝膠(支持膜上0.5mm厚凝膠)丙烯酰胺緩沖液:Immobiline?

CH2=CH-CO-NH-R,R：羧基或叔胺基固相pH梯度(IPG)第28頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月Immobiline?

干膠條的特性可重復(fù)性無梯度漂移,真正的平衡方法可分離酸性和堿性蛋白容納蛋白樣本量更多水平和垂直SDS凝膠中都能使用允許樣本水化上樣機(jī)械強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定易操作易于對樣本跟蹤標(biāo)記第29頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月新pH范圍的Immobiline干膠條高分辨率的IPG膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑,能改善極堿性區(qū)域蛋白點結(jié)果 。歸功于獨特的試劑。 使用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D圖譜分析效率!新pH范圍:Immobiline?DryStrippH3–5.6NLImmobilineDryStrippH5.3–6.5ImmobilineDryStrippH6.2–7.5ImmobilineDryStrippH7–11NLImmobilineDryStrippH3–11NL第30頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月不同pH范圍膠條不同長度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個pH范圍pH7-11NL堿性膠條第31頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月寬pH、窄pH范圍膠條寬pH梯度膠條應(yīng)用: 整個蛋白圖譜窄pH梯度膠條應(yīng)用: 提高分辨率 增加樣品上樣量 檢測分析更多蛋白pH345678910456789第32頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月提高分辨率:斑點顯現(xiàn)IPG4-7IPG5-6IPG4-7IPG5.5-6.7MouseliverproteinsFromA.G?rgetal.(1999)第33頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月不同長度的膠條7cm11cm13cm18cm24cm第34頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2D/MS（蛋白質(zhì)雙向電泳）經(jīng)典工作流程差異分析圖像獲取圖譜分析蛋白標(biāo)記圖譜分析挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向銀染

考染熒光染色第35頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月Coomassie?Blue-考馬斯亮藍(lán)染色+靈敏度，低至0.01mg(“膠體”考染)+非特異性染色+染料與蛋白成比例結(jié)合+線性化好擴(kuò)散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度純度不夠有限的動力學(xué)范圍第36頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月膠體考馬斯亮藍(lán)染色1mgE.colistrainBColloidalCBB

G250staining第37頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月銀染+靈敏度，低至0.2ng+在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián)+自動催化反應(yīng)線性化程度比考染低步驟多，某些步驟時間控制嚴(yán)格第38頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月SilverstainedgelofE.coliLysate

IPG4-7SilverstainedwithPlusOne?KitwithoutglutaraldehydeandformaldehydeintheAgsol.第39頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2D/MS經(jīng)典工作流程差異分析蛋白標(biāo)記挖點酶解點靶蛋白鑒定體液植物微生物組織細(xì)胞分離細(xì)胞裂解勻漿預(yù)分級除雜質(zhì)濃縮定量樣品制備雙向電泳第一向第二向圖像獲取圖譜分析銀染

考染熒光染色圖譜分析第40頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月ImageScannerIII圖像掃描系統(tǒng)灰度校正功能平臺具有防水功能，可直接掃描SDS濕膠。3.7OD高動態(tài)范圍，保證高、低豐度蛋白的準(zhǔn)確定量。掃描平臺大，A3掃描面積，一次可掃描2塊24cm凝膠。Gray256scaleTransmissive300dpi第41頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月由SIB,GeneBio和GEHealthcare合作開發(fā)，為SwissProt推薦分析軟件。高效能參數(shù)自動找點，全自動蛋白定量計算方法，不受背景影響。在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行分析，結(jié)果可靠。界面窗口可隨意設(shè)計，界面極其友好。全自動凝膠匹配，采用先進(jìn)的算法。根據(jù)點的相關(guān)因素、形狀、位置、周圍情況， 膠間匹配效率高。多種統(tǒng)計學(xué)分析工具，快速找到膠間蛋白表達(dá)差異?？芍苯渔溄拥紼xPASy?和SwissProt?數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行網(wǎng)上檢索。全部操作過程都可以撤銷/重作操作，每一步驟都附有說明，使用方便。全面支持DIGE技術(shù)，源