基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性深圳

基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性深圳2023/7/101第1頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因多態(tài)性

與疾病發(fā)生遺傳易感性GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease2023/7/102第2頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月提綱單核苷酸多態(tài)性

SingleNucleotidePolymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性

GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

GenePolymorphismandRegulationofGeneTranscription展望

FutureProspects2023/7/103第3頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNAStructure第4頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因突變基因突變（mutation)：由于DNA堿基對(duì)的置換、插入或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，亦稱(chēng)點(diǎn)突變。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式，基因突變可分為堿基置換突變和移碼突變兩種類(lèi)型：堿基置換突變：由一個(gè)錯(cuò)誤的堿基對(duì)替代一個(gè)正確的堿基對(duì)的突變叫堿基置換突變。堿基替換過(guò)程只改變被替換堿基的那個(gè)密碼子，也就是說(shuō)每一次堿基替換只改變一個(gè)密碼子，不會(huì)涉及到其他的密碼子。移碼突變：基因中插入或者缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)，使DNA的閱讀框架（讀碼框）發(fā)生改變，導(dǎo)致插入或缺失部位之后的所有密碼子都跟著發(fā)生變化，結(jié)果產(chǎn)生一種異常的多肽鏈。2023/7/105第5頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因突變根據(jù)遺傳信息的改變方式，基因突變又可以分為同義突變、錯(cuò)義突變和無(wú)義突變?nèi)N類(lèi)型：同義突變：DNA的一個(gè)堿基對(duì)的改變并不會(huì)影響它所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是因?yàn)楦淖兒蟮拿艽a子和改變前的密碼子是簡(jiǎn)并密碼子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱(chēng)為同義突變。錯(cuò)義突變：由于一對(duì)或幾對(duì)堿基對(duì)的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯(cuò)義突變。這種基因突變有可能使它所編碼的蛋白質(zhì)部分或完全失活。無(wú)義突變：由于一對(duì)或幾對(duì)堿基對(duì)的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子的基因突變叫無(wú)義突變。2023/7/106第6頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNPs）：是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，人類(lèi)30億堿基中大約有1000萬(wàn)個(gè)SNPs。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性可以只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition，嘌呤>嘌呤或嘧啶>嘧啶)或顛換(transversion，嘌呤<—>嘧啶)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說(shuō)的SNP并不包括后兩種情況。2023/7/107第7頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性理論上，SNPs可以分二、三和四等位基因，但人類(lèi)一般為二等位基因（biallelic）。二等位基因有4種不同類(lèi)型，包括1種轉(zhuǎn)換C>T(G>A)和3種顛換C>A(G>T)、C>G(G>C)、T>A(A>T)。四種SNPs類(lèi)型在人類(lèi)中的發(fā)生頻率不同，最常見(jiàn)的為C>T(G>A)轉(zhuǎn)換，約占2/3，其它3種類(lèi)型發(fā)生的頻率相同。之所以轉(zhuǎn)換幾率高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類(lèi)基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。2023/7/108第8頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性ExampleofanSNPcomprisingaG>AsubstitutionElectropherogramsproducedbyfluorescence-basedsequencingusinganABI3700showingthegenomicDNAfromanindividualhomozygousforGatthesiteoftheSNP(a)andanindividualhomozygousforA(b).Thebasesubstitutionisdenotedbyanarrow.第9頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性人類(lèi)基因組中大約估計(jì)每個(gè)基因有2個(gè)常見(jiàn)的錯(cuò)義突變?cè)诠矓?shù)據(jù)庫(kù)中至少有500萬(wàn)個(gè)SNPs。僅有少量（可能為50,000–250,000）SNPs在一定程度上（小到中等度）能反映與疾病發(fā)生危險(xiǎn)相關(guān)的表型。根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-regionSNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（PerigenicSNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（IntergenicSNPs，iSNPs）等三類(lèi)。SNPs在基因組中的分布十分廣泛，但不同的區(qū)域出現(xiàn)的頻率不同。人類(lèi)單堿基等位基因十分穩(wěn)定。人類(lèi)SNPs大部分(85%)是共有的。2023/7/1010第10頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性63%Intronic（內(nèi)含子）

24%Locusregion（基因座區(qū)）11%Untranslatedregion（非翻譯區(qū)）1%Nonsynonymous（nsSNPs，錯(cuò)義SNPs）1%Synonymous（同義SNPs）<1%Splicesite（剪接位點(diǎn)）<1%Unknowncodingvariant（不明編碼變異）SNPs分布區(qū)域：2023/7/1011第11頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性SNPs應(yīng)用多基因病和復(fù)雜性疾病如人類(lèi)腫瘤、糖尿病、自身免疫性疾病、老年性癡呆等的遺傳連鎖分析(linkageanalysis)及關(guān)聯(lián)分析(associationanalysis)，用于疾病易感基因定位和克隆。“藥物基因組學(xué)”(pharmacogenomics)研究中用于揭示人群中不同個(gè)體對(duì)不同藥物的敏感性差異的根本原因。法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等。在器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇。研究人類(lèi)起源、進(jìn)化和群體遺傳學(xué)特征。人類(lèi)基因組SNPs研究所揭示的人種、人群和個(gè)體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對(duì)疾病的診斷、治療和預(yù)防帶來(lái)革命性的變化。

2023/7/1012第12頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月單核苷酸多態(tài)性今后SNP的研究主要包括兩個(gè)方面：SNP數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建：主要目的是發(fā)現(xiàn)特定種類(lèi)生物基因組的全部或部分SNP。大規(guī)模SNP數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建只是基因組序列分析中心可以勝任的工作,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室是不太可能進(jìn)行該工作的。SNP功能的研究：發(fā)現(xiàn)SNP只是SNP研究的第一步，而SNP功能的研究才是SNP研究的目的。特定DNA區(qū)域的特定SNP在特定群體的序列驗(yàn)證和頻率分析以及SNP與特定生理/病理狀態(tài)關(guān)系的研究是SNP研究的主要方面。2023/7/1013第13頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月提綱單核苷酸多態(tài)性

SingleNucleotidePolymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性

GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

GenePolymorphismandRegulationofGeneTranscription展望

FutureProspects2023/7/1014第14頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月問(wèn)題基因選擇哪些基因和位點(diǎn)值得研究？相對(duì)于全基因組，候選基因研究有何優(yōu)點(diǎn)？如何將SNP功能信息融入相關(guān)性研究中？實(shí)驗(yàn)室方面如何選擇合適的實(shí)驗(yàn)室方法？如何進(jìn)行質(zhì)量控制？如何利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)信息？研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析何種研究設(shè)計(jì)和分析方法是實(shí)現(xiàn)研究重現(xiàn)性所必需？如何處理人群遺傳結(jié)構(gòu)上的差異，如單倍體區(qū)段、種族差異等？2023/7/1015第15頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因選擇各物種基因數(shù)量比較物種 基因數(shù)量小鼠（Mouse） 30,000擬南芥（Arabidopsis） 27,000人類(lèi)（Human） 25,000線蟲(chóng)（C.elegans） 19,5002023/7/1016第16頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因選擇候選基因（CandidateGenes）候選基因具有對(duì)生物學(xué)合理性(biologicalplausibility)和疾病因果關(guān)系(diseasecausality)作最大化推理(maximizinginferences)的優(yōu)點(diǎn)。候選基因可根據(jù)某一特定疾病發(fā)生過(guò)程中基因功能信息來(lái)加以限制。2023/7/1017第17頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因選擇生物學(xué)上的考慮：基于疾病的發(fā)病機(jī)制(生物學(xué)合理性、權(quán)威的科學(xué)假說(shuō)等)易感基因（susceptivegenes）敏感基因（sensitivegenes）生物學(xué)通路（biologicalpathways）2023/7/1018第18頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ApoptosisPathway第19頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月BaseExcisionRepairPathway第20頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月NucleotideExcisionRepair第21頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DoubleStrandBreakRepairPathway第22頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TranscriptionCoupledRepairPathway第23頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CystathionineMTHFRTS/TYMSMTHFR=methylenetetrahydrofolatereductaseTS/TYMS=thymidylatesynthaseFS=10-formylTHFsynthaseSHMT=serinehydroxymethyltransferaseMTHFD=5,10-methylenetetrahydrofolatedehydrogenaseMS/MTR=methioninesynthaseMTRR=methioninesynthasereductaseBHMT

=batainehydroxymethyltransferaseDHFR=dihydrofolatereductaseCBS=cystathionine-synthaseCBSMS/MTRDHFRMTRRSHMTBHMTFSMTHFDFolateMetabolismPathway第24頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DNADamage-ResponsePathwayp53ProteinAccumulation

DNADAMAGEBindingtoTranscription-Replication-RepairFactorsTFIIH(XPB,XPD)andp62bindstop53PCNA(p21WAF1andGADD45)AlteredExpressionBAXandFasBcl2IncreasedExpressionp21WAF1,MDM2,cyclinG,andGADD45CellCycleArrestDNARepairCancerApoptosisTranscriptionDependentApoptosisTranscriptionIndependent

ApoptosisModifiedfromHarris,1994第25頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因選擇藥物治療反應(yīng)（treatmentresponse）基因表達(dá)改變（geneexpressionchanges）病人的存活狀況（survivalstatus）藥物的毒副反應(yīng)（sideeffectsortoxicities）這些因素與某一特定藥物、后續(xù)事件的時(shí)序以及劑量等有關(guān)。如在藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)研究領(lǐng)域，在選擇候選基因時(shí)可考慮下列因素：2023/7/1026第26頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月多態(tài)性位點(diǎn)選擇復(fù)雜疾病的易感性往往是由稀少的變異（rarevariants）所決定。牛津大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)系的Pritchard在美國(guó)人類(lèi)遺傳學(xué)雜志上發(fā)表了“Arerarevariantsresponsibleforsusceptibilitytocomplexdiseases?”綜述闡述了這一觀點(diǎn)。nsSNPs或調(diào)控SNPs（rSNPs，指可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控改變的SNPs）是人類(lèi)個(gè)體間差異的重要分子基礎(chǔ)。未來(lái)研究的重要挑戰(zhàn)是對(duì)rSNPs的識(shí)別和功能揭示。2023/7/1027第27頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月多態(tài)性位點(diǎn)選擇選擇次序編碼區(qū)SNPs：外顯子(exon)非編碼區(qū)SNPs啟動(dòng)子區(qū)(promoterregion)5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)剪接位點(diǎn)(splicesite)3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)內(nèi)含子(intron)2023/7/1028第28頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月多態(tài)性位點(diǎn)選擇全基因組和基于單倍體型的研究合適的流行病學(xué)設(shè)計(jì)和足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)功效（statisticalpower）是必需的。盡管全基因組研究不易重復(fù)，但仍可識(shí)別基因組中與疾病發(fā)生存在因果關(guān)系的區(qū)域（causativeregions）。連鎖不平衡區(qū)段（linkagedisequilibriumblocks)存在于整個(gè)基因組中，但其長(zhǎng)度可因人群遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異而不同。采用單倍體區(qū)段（haplotypeblock）的信息較單純基于SNP的分析可提高15–50%的功效。2023/7/1029第29頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月總結(jié)全基因組研究方法在今后的研究中是可行的，但在高通量、數(shù)據(jù)庫(kù)以及統(tǒng)計(jì)分析方面將面臨巨大挑戰(zhàn)。候選基因方法在確定特定疾病因果關(guān)系上仍然具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性的功能學(xué)意義是理解和認(rèn)識(shí)流行病學(xué)相關(guān)性研究生物學(xué)基礎(chǔ)的關(guān)鍵。在相關(guān)性研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)該深入探討SNPs的功能，包括對(duì)基因翻譯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等的作用。2023/7/1030第30頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)室研究高并聯(lián)（highparallel）：小樣本多位點(diǎn)高通量（highthroughput）：大樣本少位點(diǎn)理想的基因分型方法應(yīng)包括5-10%重復(fù)樣本優(yōu)化實(shí)驗(yàn)通量和質(zhì)量控制，兩種方案：2023/7/1031第31頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)室研究實(shí)驗(yàn)室研究的主要問(wèn)題是質(zhì)量控制基因型的錯(cuò)誤分類(lèi)(misclassification)可導(dǎo)致偏倚(bias)常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室問(wèn)題包括DNA污染、DNA質(zhì)量或數(shù)量不合適、樣本/板方向標(biāo)錯(cuò)、檢測(cè)誤差等?；蚍中蜁r(shí)應(yīng)包括盲樣重復(fù)、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。對(duì)于病例—對(duì)照研究，病例和對(duì)照樣本不應(yīng)分開(kāi)檢測(cè)以減少潛在的錯(cuò)誤。2023/7/1032第32頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)室研究基因多態(tài)性的檢測(cè)方法

PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR-SSCP（singlestrandconformationpolymorphism）：?jiǎn)捂湗?gòu)像多態(tài)性分析PCR-SSP（SequenceSpecificPrimers）：序列特異引物聚合酶鏈反應(yīng)DNASequencing：DNA測(cè)序PCR-ASO（allelespecificoligonucleotide）：等位基因特異性寡核苷酸探針?lè)≒CR-SSO（sequencespecificoligonucleotide）：順序特異寡核苷酸法PCR-熒光法PCR-fingerprints：PCR指紋圖法DNAMicroarray：DNA微探針陣列，又稱(chēng)基因芯片法AFLP（amplicationfragmentlengthpolymorphism）：擴(kuò)增基因組DNA限制性片段法DGGE（denaturinggradinentelectrophoresis）：變性梯度凝膠電泳法RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）：隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA法2023/7/1033第33頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源公共數(shù)據(jù)庫(kù)和資源，常用的網(wǎng)址如下：/SNP(NationalCenterforBiotechnologyInformation)/(NIEHSSNPsProgram)/home_1.cfm?CFID=264728&CFTOKEN=86045010(SNP500Cancer)/entrez/query.fcgi(Pubmed)http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.html(SNPsdatabasefromJapan)http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/(HUGOGeneNomenclatureCommittee)/genome/seq/HsBlast.html(Blastsearch)……2023/7/1034第34頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源存在的問(wèn)題數(shù)據(jù)庫(kù)中存在許多錯(cuò)誤：所報(bào)告的編碼區(qū)5-16%的SNPs因復(fù)制片段(復(fù)制子,duplicon)而成為共生同源變異(paralogousvariants),因此并非真正的SNPs。有15–30%的SNPs沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證（verified），因此可能是不存在的。數(shù)據(jù)庫(kù)往往是基于少量的信息因?yàn)镾NP頻率存在種族差異，因此SNP頻率如果沒(méi)有種族類(lèi)型報(bào)告，該數(shù)據(jù)可能是不可用的。2023/7/1035第35頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析疾病遺傳易感性的分子流行病學(xué)研究：利用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的技術(shù)和手段，在疾病發(fā)病機(jī)制方面開(kāi)展的基因多態(tài)性、基因與環(huán)境交互作用等相關(guān)的研究。常見(jiàn)的研究方法包括病例—對(duì)照研究、前瞻性隊(duì)列研究、病例—病例研究等。2023/7/1036第36頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析以現(xiàn)在確診的患有某特定疾病的病人作為病例，以不患有該病但具有可比性的個(gè)體作為對(duì)照，通過(guò)詢(xún)問(wèn)，實(shí)驗(yàn)室檢查或復(fù)查病史，搜集既往各種可能的危險(xiǎn)因素的暴露史，測(cè)量并比較病例組與對(duì)照組中各因素的暴露比例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，若兩組差別有意義，則可認(rèn)為因素與疾病之間存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)上的關(guān)聯(lián)。一種回顧性的，由結(jié)果探索病因的研究方法，是在疾病發(fā)生之后去追溯假定的病因因素的方法。分為病例與對(duì)照不匹配（unmatching）和病例與對(duì)照匹配(matching)兩種類(lèi)型。匹配要求對(duì)照在某些因素或特征上與病例保持一致，目的是對(duì)兩組進(jìn)行比較時(shí)排除匹配因素的干擾：分為頻數(shù)匹配(frequency-matching)和個(gè)體匹配（1:1,1:2…1:R，一般不超過(guò)1:4，否則統(tǒng)計(jì)效率下降）。病例—對(duì)照研究（Case-ControlStudy)2023/7/1037第37頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析病例與對(duì)照的基本來(lái)源有兩個(gè):一個(gè)來(lái)源是醫(yī)院的現(xiàn)患病人、醫(yī)院、門(mén)診的病案，及出院記錄，稱(chēng)為以醫(yī)院為基礎(chǔ)的（hospital-based）；另一個(gè)來(lái)源是社區(qū)、社區(qū)的監(jiān)測(cè)資料或普查、抽查的人群資料，稱(chēng)為以社區(qū)為基礎(chǔ)的（community-based）。病例的選擇主要是確定判斷病人的標(biāo)準(zhǔn)和怎樣獲得這些符合判斷標(biāo)準(zhǔn)的病人；對(duì)照最好是全人群的一個(gè)無(wú)偏樣本，或是產(chǎn)生病例的人群中全體非患該病的人的一個(gè)隨機(jī)樣本，而且也經(jīng)過(guò)相同診斷確認(rèn)為不患所研究的疾病。病例—對(duì)照研究（Case-ControlStudy)2023/7/1038第38頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析影響樣本大小的因素:

病例對(duì)照研究樣本大小取決于四個(gè)參數(shù)

1.研究因素在對(duì)照人群中的暴露率(P0)

2.預(yù)期暴露于該研究因素造成的相對(duì)危險(xiǎn)度(RR)或比值比(OR)

3.希望達(dá)到的檢驗(yàn)性水平，即假設(shè)檢驗(yàn)第I類(lèi)錯(cuò)誤，即假設(shè)檢驗(yàn)所允許的假陽(yáng)性錯(cuò)誤的概率。

4.希望達(dá)到的檢驗(yàn)把握度(1-)，為假設(shè)檢驗(yàn)第II類(lèi)錯(cuò)誤，即假設(shè)檢驗(yàn)所允許的假陰性錯(cuò)誤的概率。 病例—對(duì)照研究（Case-ControlStudy)2023/7/1039第39頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析樣本量估計(jì)方法：不同配比方式的樣本大小計(jì)算方法不同，可用公式計(jì)算或從樣本量表中查得。需要注意的是：所估計(jì)的樣本含量并非絕對(duì)精確的數(shù)值，因?yàn)闃颖竞康墓烙?jì)是有條件的，而這些條件并非是一成不變的。應(yīng)當(dāng)糾正樣本量越大越好的錯(cuò)誤看法。樣本量過(guò)大，常會(huì)影響調(diào)查工作的質(zhì)量，增加負(fù)擔(dān)、費(fèi)用。病例組和對(duì)照組樣本含量相等時(shí)效率最高。病例—對(duì)照研究（Case-ControlStudy)2023/7/1040第40頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析如頻率匹配的病例對(duì)照研究樣本量估計(jì)N=2×A×(1-A)×(Z+Z)2/(p1-p0)2式中:N為病例組和對(duì)照組人數(shù),Z、Z分別為及值相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布分位數(shù)，可查表求得，p0和p1分別為對(duì)照組和病例組某因素的估計(jì)暴露率。

q0=1-p0,

q1=1-p1,A=(p0+p1)/2其中p1也可由計(jì)算公式求得:p1=(OR×p0)/(1-p0+OR×p0)，也可簡(jiǎn)化成p1=(OR×p0)/[1+p0(OR-1)]。2023/7/1041第41頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析

標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)表

或

Z(單側(cè)檢驗(yàn))

Z(雙側(cè)檢驗(yàn))

Z(單側(cè)和雙側(cè)檢驗(yàn))

0.001

3.090

3.290

0.002

2.878

3.090

0.005

2.576

2.807

0.010

2.326

2.576

0.020

2.058

2.326

0.025

1.960

2.242

0.050

1.645

1.960

0.100

1.282

1.645

0.200

0.842

1.282

2023/7/1042第42頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析樣本量大小估計(jì)舉例擬進(jìn)行一項(xiàng)病例對(duì)照研究，研究吸煙和肺癌的關(guān)系。一般人群吸煙率約為20%，吸煙和肺癌的比值比為2.0，要求=0.05（雙側(cè)），=0.10，估計(jì)樣本大小N。

求p1：p1=(2×0.2)/(1-0.2+2×0.2)=0.333

q0=1-0.2=0.8

q1=1-0.333=0.667

A=(0.2+0.333)/2=0.267

查標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分位數(shù)表得Z=1.960,

Z=1.282

N=2×0.267×(1-0.267)×(1.960+1.282)2/(0.333-0.2)2=232即每組需要232人。2023/7/1043第43頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CancerCancer-freeCase-ControlStudySusceptibility:Diet,Metabolism,DNAdamage&Repair…Carcinogenes

Oddsratio(OR)toestimate

relativerisk–probabilityofdevelopingcancerOR=1,noriskOR>1,increasedriskOR<1,protectiveeffectQuestionnairedataBiomarkerassays第44頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析以基于醫(yī)院的腫瘤病例—對(duì)照研究為例病例：病人應(yīng)為新診斷、病理學(xué)確診；未經(jīng)放療或化療；無(wú)腫瘤病史；無(wú)輸血史…對(duì)照：無(wú)腫瘤者，可從醫(yī)療或保健機(jī)構(gòu)中招募的，與病例無(wú)生物學(xué)上相關(guān)的醫(yī)療求助者或病人陪伴著。病例應(yīng)與對(duì)照在年齡、性別、種族和吸煙狀況上在頻率上相匹配或采用個(gè)體匹配。正式的知情同意書(shū)、流行病學(xué)調(diào)查表和血液采集。統(tǒng)計(jì)分析：采用t檢驗(yàn)、方差檢驗(yàn)和多因素logistic回歸分析等。2023/7/1045第45頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析選定暴露于及未暴露于某因素的兩組人群，隨訪觀察一定的期間，比較兩組人群某種疾病的結(jié)局，從而判斷該因素與發(fā)病或死亡有無(wú)關(guān)聯(lián)及關(guān)聯(lián)大小的研究方法。特點(diǎn)屬于觀察法，需設(shè)立對(duì)照組。由“因”及“果”，時(shí)序合理，檢驗(yàn)暴露因素與疾病的因果聯(lián)系科學(xué)性強(qiáng)。最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲取相對(duì)真實(shí)而可靠的資料。但是如果需要觀察大量人群，則花費(fèi)太大。如果疾病的潛伏期很長(zhǎng)，則需要觀察的時(shí)間很長(zhǎng)。這些都會(huì)影響其可行性。用途檢驗(yàn)病因假設(shè)：驗(yàn)證某種暴露因素對(duì)某種疾病發(fā)病率或死亡率的影響，也可同時(shí)觀察某種暴露因素對(duì)人群健康的系統(tǒng)影響。描述疾病的自然史：疾病的自然發(fā)展過(guò)程，包括疾病的起?。ú±戆l(fā)生期）、潛伏期(隱伏期)、臨床前期、臨床期到結(jié)局的全過(guò)程。前瞻性隊(duì)列（或群組）研究（CohortStudy)2023/7/1046第46頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Susceptibility:Diet,Metabolism,DNAdamage&Repair…Carcinogenes

CancerCancer-freeGeneticpredisposition?(遺傳易患體質(zhì)？)Biomarkersforpreventionandearlydetection?CohortStudy第47頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析又稱(chēng)為單純病例研究（caseonlystudy）或病例系列研究（caseseriesstudy）。病例-病例研究是近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于疾病病因研究中評(píng)價(jià)基因與環(huán)境交互作用的一種方法，該方法僅通過(guò)某一疾病患者群體來(lái)評(píng)價(jià)基因型與環(huán)境暴露的交互作用，但不能評(píng)價(jià)二者各自的主效應(yīng)。有時(shí)在一般病例對(duì)照研究中不易選擇合適的對(duì)照，特別是在分子流行病學(xué)研究中，從無(wú)疾病的對(duì)照中去獲取某種生物標(biāo)本也受到醫(yī)學(xué)倫理方面的制約。如果對(duì)一種疾病的兩個(gè)亞型進(jìn)行對(duì)比研究，例如出血型腦卒中與缺血型腦卒中、p53突變陽(yáng)性基因型的食管癌與p53突變陰性基因型的食管癌或者食管癌的鱗癌與腺癌的比較研究，可以不另外設(shè)對(duì)照組，而采取兩個(gè)亞組的直接比較。這種設(shè)計(jì)可以免除從無(wú)病的對(duì)照組收集資料特別是生物標(biāo)本的麻煩，適用于研究?jī)山M病因的差異部分，而其相同或近似的危險(xiǎn)因素則將被掩蓋或低估。病例-病例研究（Case-CaseStudy）2023/7/1048第48頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用的前提條件：在正常人群中基因型與環(huán)境暴露各自獨(dú)立發(fā)生，而且所研究的疾病為罕見(jiàn)病(此時(shí)可用OR來(lái)估計(jì)RR值)?；静襟E：確定某一患者群體作為研究對(duì)象收集病人的一般情況、協(xié)變量、環(huán)境暴露資料，以及生物標(biāo)本。采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因型根據(jù)某一基因型的有無(wú)將研究對(duì)象分為類(lèi)病例組和類(lèi)對(duì)照組統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算OR值、P值。判斷有無(wú)相乘模型的交互作用及顯著性意義。若有，進(jìn)一步判斷為正相乘作用還是負(fù)相乘作用。病例-病例研究（Case-CaseStudy）2023/7/1049第49頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月BloodSampleProcessingandBiomarkerAssayFlowChartPHAPHASpinWholebloodshort-termculture1ml1ml1mlMutagensensitivityassayBPDE

ControlBPDEGamma1mlBPDE-InduceDNAadductsassayDNAextraction1mlRT-PCRforgeneexpressionLong-termstoragecDNADNA1mlRNAextractionGenotypingLymphocyteisolation(frozen)CAT/LucassaysDNArepaircapacity2mleachTransfectionHeparinized,10-30mlSamplecollection(casesandcontrols)1mlPlasmaSerum第50頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)性研究結(jié)果可重復(fù)嗎？

遺憾的是，大多數(shù)結(jié)果不能重復(fù)。假陽(yáng)性報(bào)告（false-positivereports)：偽相關(guān)（spuriousassociations)假陰性報(bào)告（false-negativereports）：該研究無(wú)足夠的效能來(lái)識(shí)別該相關(guān)性人群之間存在的差異（populationdifferences）2023/7/1051第51頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析在相關(guān)性研究結(jié)果缺乏一致性時(shí)，應(yīng)采用何種可信度水平？大樣本(largesamplesize)避免出版偏差(avoidpublicationbias)種族分層(ethnicstratification) …2023/7/1052第52頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析影響相關(guān)性研究結(jié)果的因素：病因?qū)W上的復(fù)雜性

(etiologicalcomplexity)統(tǒng)計(jì)效能和采樣設(shè)計(jì)

(statisticalpowerandsamplingdesign)人群結(jié)構(gòu)

(populationstructure)數(shù)據(jù)解釋

(datainterpretation)2023/7/1053第53頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)解釋?zhuān)―ataInterpretation）

有幾種情況：顯著關(guān)聯(lián)、無(wú)重要關(guān)聯(lián)、無(wú)法決定。假陽(yáng)性報(bào)告概率（falsepositivereportprobability，F(xiàn)PRP）有助于作出判斷FPRP取決于先驗(yàn)概率（priorprobability）、統(tǒng)計(jì)效能（statisticalpower）和效能指數(shù)（effectsize）。統(tǒng)計(jì)效能：指當(dāng)H0為錯(cuò)時(shí)你正確地拒絕H0的概率（significanceoftherelationshipundertest）效能指數(shù)：是指被檢驗(yàn)的兩變量之間關(guān)系的強(qiáng)度(strengthoftherelationshipundertest）。兩者均與樣本大小有關(guān)。2023/7/1054第54頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)解釋?zhuān)―ataInterpretation）當(dāng)先驗(yàn)概率較高時(shí)，那么假陽(yáng)性報(bào)告概率將較低，其關(guān)聯(lián)性將更趨正確。研究者必須選擇一個(gè)臨床或病因?qū)W上有意義的效能指數(shù)，如相對(duì)危險(xiǎn)度（relativerisk，RR）或比值比（oddsratio,OR）以及先驗(yàn)范圍。通常我們計(jì)算并比較OR值及其95%可信限（95%confidenceinterval,95%CI）。2023/7/1055第55頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月提綱單核苷酸多態(tài)性

SingleNucleotidePolymorphism基因多態(tài)性與疾病發(fā)生遺傳易感性

GenePolymorphismandGeneticSusceptibilitytoDisease基因多態(tài)性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

GenePolymorphismandRegulationofGeneTranscription展望

FutureProspects2023/7/1056第56頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子與基因轉(zhuǎn)錄第57頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PromoterRegion第58頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ControlsitesinDNAprovidebindingsitesforproteins;codingregionsareexpressedviathesynthesisofRNA第59頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本概念啟動(dòng)子(promoter):位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游的一段DNA序列指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合活化RNA聚合酶啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)(promoterregion):RNA聚合酶(RNApolymerases)同啟動(dòng)子結(jié)合的區(qū)域RNA聚合酶:利用DNA模板合成RNA的酶2023/7/1060第60頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶的活性形式(全酶)為15S，由5種不同的多肽鏈構(gòu)成，按分子量大小排列分別為β‘(155000)，β(151000)，σ(7000)，α(36500)和ω(11000)。每分子RNA聚合酶除有兩個(gè)α亞基外，其余亞基均只有一個(gè)，故全酶為β’βα2σω(450000)

。全酶是指酶蛋白及其輔酶構(gòu)成的有功能的復(fù)合物。第61頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ThefunctionofRNApolymeraseistocopyonestrandofduplexDNAintoRNA第62頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本概念共有序列(consensussequence)是指與真實(shí)序列相比，啟動(dòng)子每個(gè)位置最常出現(xiàn)的理想化堿基序列。即將所有已知啟動(dòng)子排列起來(lái)以求其最大相似性。一個(gè)序列如果為共有，則每一個(gè)特定堿基都理應(yīng)在相應(yīng)位置上有分布優(yōu)勢(shì)。大多數(shù)共有序列間的堿基差異不能超過(guò)1-2個(gè)。2023/7/1063第63頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)

有多種元件：TATA框、GC框、CATT框、OCT等。結(jié)構(gòu)不恒定：有的有多種框盒如組蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期轉(zhuǎn)錄蛋白。它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同。有的存在遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件，如增強(qiáng)子。這些元件常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作用。不直接和RNA聚合酶結(jié)合。轉(zhuǎn)錄時(shí)先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合。真核生物中有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種不同的啟動(dòng)子，其中以啟動(dòng)子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核的啟動(dòng)子有很多不同：2023/7/1064第64頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，只有帶σ因子的全酶才能專(zhuān)一地同啟動(dòng)子結(jié)合。RNA聚合酶沿著模板前進(jìn)，直到終止子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條RNA鏈。通常把基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)前面即5’端的序列稱(chēng)為上游(upstream)，起點(diǎn)后面即3’端的序列稱(chēng)為下游(downstream)。并把起點(diǎn)的位置記為+1，下游的核苷酸依次記為+2，+3，……，上游方向依次記為-1，-2，-3，……啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)

2023/7/1065第65頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)在真核基因中，有少數(shù)基因沒(méi)有TATA框。沒(méi)有TATA框的真核基因啟動(dòng)子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的則沒(méi)有GC框。GC框位于-80~-110bp處的GCCACACCC或GGGCGGG序列。TATA框的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始；CAAT框和GC框則主要是控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，特別是CAAT框?qū)D(zhuǎn)錄起始頻率的作用更大。在真核生物中，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游70-80bp處有CAAT順序，也稱(chēng)為CAAT盒，是比較保守的共有序列：GCCTCAATCT。2023/7/1066第66頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合

研究策略第67頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月背景基因轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是關(guān)鍵。常常某個(gè)基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)決定于在特定的啟動(dòng)子起始過(guò)程。啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過(guò)與啟動(dòng)子DNA結(jié)合以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。猶如抗原-抗體特異性結(jié)合一樣，蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合也是特異的，這是研究啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合蛋白的前提。2023/7/1068第68頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentdomainsoftheprotein第69頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究方案細(xì)胞內(nèi)法(invivo):以已知啟動(dòng)子DNA序列篩選出與其相結(jié)合的蛋白編碼基因,通過(guò)生物信息分析來(lái)確定該蛋白質(zhì)的名稱(chēng)。優(yōu)點(diǎn)：更符合生理狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，適合大通量篩選，用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：一是只能篩選可與啟動(dòng)子DNA特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，但不能檢查出精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)；二是特異性略差。常用的有酵母單雜交(Yeastonehybrid)技術(shù)、噬菌體表面展示(Phagedisplay)技術(shù)等。2023/7/1070第70頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究方案細(xì)胞外法(invitro)：即在體外用重組的已知蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子DNA結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：特異性好，且能夠在啟動(dòng)子DNA序列上找到精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。缺點(diǎn)：效率低，操作復(fù)雜，一般不用于尋找未知基因及蛋白質(zhì)。常用的有EMSA(electrophoreticmobility-shiftassay)、DNaseIfoot-printingassay等。2023/7/1071第71頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月凝膠遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)基本原理為：在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，小分子DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽(yáng)極移動(dòng)的速度快。若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，則其向陽(yáng)極移動(dòng)的速度受到阻滯，在凝膠放射性自顯影上或生物素標(biāo)記，就可找到DNA結(jié)合蛋白。2023/7/1072第72頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月超級(jí)EMSA超級(jí)EMSA，即Super-shiftassay,是EMSA試驗(yàn)的改進(jìn)，將DNA與更多的蛋白結(jié)合，這樣，與特異性蛋白結(jié)合的目的DNA移動(dòng)速度進(jìn)一步減慢。由于凝膠遷移率變動(dòng)試驗(yàn)的特異性好，常用來(lái)鑒定其它方法篩選出的結(jié)果。顯而易見(jiàn)，克隆啟動(dòng)子DNA片段并標(biāo)記，用該實(shí)驗(yàn)就可找到相應(yīng)的結(jié)合蛋白。2023/7/1073第73頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EMSA優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、敏感缺點(diǎn):需已知目標(biāo)DNA序列DNA序列較短,一般為20-30個(gè)核苷酸。體外（非體內(nèi)）檢測(cè)方法2023/7/1074第74頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EMSA原理(a)ThebindingsiteofinterestissynthesizedasashortradiolabelledDNAprobewhichcanbeusedtoidentifybothknownandnovelfactorsbindingtothecandidateregion.OnceboundtoDNA,aprotein–DNAcomplexisstabilizedwhensubjectedtonon-denaturingPAGE,allowingresolutionofprotein–DNAcomplexesasdiscretebands.(b)Thespecificityoftheinteractionmaybeinvestigatedbycompetitionexperimentsinwhichtypically10-or100-foldexcessunlabelledprobeisadded,which,inthecaseofaspecificcompetitorprobe,resultsinprogressivelylessradiolabelledprobeboundbythetranscriptionfactorprotein.第75頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNaseI足跡試驗(yàn)足跡試驗(yàn)（foot-printingassay）不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合的堿基部位。足跡試驗(yàn)的方法較多，常用的有DNaseI足跡試驗(yàn)、硫酸二甲酯(dimethylsulfate,DMS)足跡試驗(yàn)，二者原理基本相同?；驹恚旱鞍捉Y(jié)合在DNA片段上，保護(hù)結(jié)合部位不被DNaseI破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒(méi)有放射性標(biāo)記條帶。2023/7/1076第76頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PrincipleoftheDNaseIfoot-printingassay(含乳糖操縱子DNA)(乳糖阻遏物)第77頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PrincipleoftheDNaseIfoot-printingassay第78頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNaseI足跡試驗(yàn)技術(shù)流程：1.標(biāo)記探針：待檢雙鏈DNA分子用32P作末端標(biāo)記，通常只標(biāo)記一端。2.結(jié)合和消化：蛋白質(zhì)與DNA混合，待二者結(jié)合后，加入適量的DNaseI以消化DNA分子，控制酶的用量，使之達(dá)到每個(gè)DNA分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，同時(shí)設(shè)未加蛋白質(zhì)的對(duì)照。3.電泳和顯影：從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測(cè)序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對(duì)照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。2023/7/1079第79頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子區(qū)SNPs

的功能研究第80頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月背景編碼DNA(CodingDNA)：外顯子(exons)

氨基酸改變或轉(zhuǎn)錄mRNA非編碼DNA(Non-codingDNA)：?jiǎn)?dòng)子(promoter)、內(nèi)含子(introns)、5’-非翻譯區(qū)(5’-UTR)、3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)

基因表達(dá)(假定的調(diào)控區(qū)，putativeregulatoryregions)

轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng)子區(qū))2023/7/1081第81頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月背景如果SNPs發(fā)生在DNA編碼區(qū)，可引起翻譯蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生改變，即使是同義突變(synonymousmutation)，該SNPs的功能效應(yīng)也可在mRNA水平檢出。如果SNPs發(fā)生在非編碼區(qū)，特別是基因上游的啟動(dòng)子區(qū)，則可能影響基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。如果SNPs位于某轉(zhuǎn)錄因子的共有序列中，將可能改變?cè)撧D(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的親和性(affinity),或引入一個(gè)新的因子與DNA結(jié)合，從而可能改變?cè)摶蜣D(zhuǎn)錄過(guò)程的特異性和動(dòng)力學(xué)特征。發(fā)生在非編碼區(qū)的SNPs的功能效應(yīng)難以直接檢出，必須通過(guò)諸如轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)等手段間接檢測(cè)。2023/7/1082第82頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)基因的啟動(dòng)子區(qū)域中含有許多重要的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列（順式元件），若要闡明基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制（包括啟動(dòng)子區(qū)SNPs功能研究），克隆啟動(dòng)子序列是必不可缺的關(guān)鍵一環(huán)。到目前為止，已闡明啟動(dòng)子序列以及它們的調(diào)控機(jī)制的基因數(shù)量非常有限。標(biāo)準(zhǔn)的真核生物有關(guān)的啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)EukaryoticPromoterDatabase中登錄的基因啟動(dòng)子也不過(guò)數(shù)百個(gè)，其中一個(gè)重要原因之一是許多基因未能確切的確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。2023/7/1083第83頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)理想的克隆cDNA應(yīng)包含模板mRNA的5‘帽的結(jié)構(gòu)以及3’多聚A尾的全長(zhǎng)序列。傳統(tǒng)的方法克隆的cDNA，多數(shù)情況下其5‘末端為部分缺失狀態(tài)。究其原因有二：一是在以mRNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄酶在從模板mRNA中脫落，只能得到部分拷貝的cDNA產(chǎn)物。二是在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，用了部分5‘末端被降解的mRNA為模板合成cDNA。因此，在構(gòu)建cDNA文庫(kù)中得到的多數(shù)是5‘末端部分缺失狀態(tài)的cDNA。換言之，在構(gòu)建cDNA文庫(kù)的過(guò)程中，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶以及應(yīng)用極易受降解的mRNA是不可避免的，因此5’末端部分缺失就不足為奇了。2023/7/1084第84頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)S1核酸酶作圖法、引物延伸法(RT)、5‘-RACE(rapidamplificationofcDNAends)法等傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的確定方法，技術(shù)要求比較高，且有時(shí)由于種種原因，難以確定確切的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。隨著生物信息學(xué)（Bioinformatics)的發(fā)展，網(wǎng)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)逐漸豐富，這為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的研究提供了一個(gè)新的思路。最近，由日本鈴木等開(kāi)發(fā)的寡核苷酸帽法(Oligocapingmethod)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中，隨機(jī)的克隆全長(zhǎng)的cDNA，適合于大規(guī)模、精確的獲得基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的信息

(SuzukiY,2002)。2023/7/1085第85頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物信息學(xué)方法大體步驟獲取基因轉(zhuǎn)錄本信息：尋找盡可能長(zhǎng)的5‘端cDNA基因CpG島分析：采用網(wǎng)絡(luò)在線軟件，綜合評(píng)價(jià)有關(guān)CpG島、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及預(yù)計(jì)起始位點(diǎn)下游的信息，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起始作出預(yù)測(cè)。啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)2023/7/1086第86頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物信息學(xué)方法常見(jiàn)的網(wǎng)上在線生物信息學(xué)軟件：/molbio/proscan/index.html/molbio/signal/index.html/pub/programs/alibaba2//software/proscan/promoterscan.htm/cgi-bin/tess/tess/index.html?org=Human&db=hg17&hgsid=41271104http://www.cephb.fr/……2023/7/1087第87頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物信息學(xué)方法實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建質(zhì)粒：根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建5‘和3’缺失片段作為候選啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)計(jì)引物。以正常人基因組DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增各片段，酶切后連入基本載體中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞：分別設(shè)立陰性、陽(yáng)性和內(nèi)對(duì)照。測(cè)定轉(zhuǎn)錄活性確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2023/7/1088第88頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月寡核苷酸帽法（OligoCapingApproach）

傳統(tǒng)的cDNA克隆化技術(shù)的缺點(diǎn)

2023/7/1089第89頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月寡核苷酸帽法（OligoCapingApproach）全長(zhǎng)cDNA的克隆

2023/7/1090第90頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月寡核苷酸帽法（OligoCapingApproach）全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

2023/7/1091第91頁(yè)，課件共102頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子區(qū)SNPs功能研究方法DNA-蛋白結(jié)合體外檢測(cè)（Invitro）凝膠遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（EMSA）DNaseI足跡試驗(yàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（Transienttransfection）

CATassayLuciferaseassay體內(nèi)測(cè)定其功能（Invivo）采用具有不同基因型和與表型相關(guān)的細(xì)胞基因組足跡試驗(yàn)：硫酸二甲酯（dimethylsulfate，DMS）、哌啶裂解（pipe