分子生物實(shí)驗(yàn)

分子生物實(shí)驗(yàn)一、名詞解釋（5×3’）1.Plasmid:質(zhì)粒，是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，是染色體外小型雙鏈環(huán)狀的DNA，大小在1-200kb之間，質(zhì)粒能自主復(fù)制，在細(xì)菌中不斷復(fù)制自身。2.Polymerasechainreaction:聚合酶鏈反應(yīng)：即PCR技術(shù)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴(kuò)增特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。包括高溫變性（94℃）-低溫復(fù)性（50-60℃）-中溫延伸（72℃）三個(gè)過程。3.RecombinantDNA:DNA重組：就是采用人工手段將不同來源的DNA片段進(jìn)行重組，以達(dá)到改變生物基因型和獲得特定基因產(chǎn)物的目的的一種生物技術(shù)。簡言之，外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組。4.Blue-whitescreening:藍(lán)白斑篩選：重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子。5.Shuttleplasmidvector:穿梭質(zhì)粒載體：是指一類人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。這些穿梭質(zhì)粒載體不僅可以在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增，也可以在相應(yīng)的枯草、酵母、動(dòng)物或植物細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。這樣利于對(duì)質(zhì)粒的分子生物學(xué)操作和大量制備。6.Competent:感受態(tài)：細(xì)菌處于易吸收外源DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)，其原理是細(xì)菌處于0℃Calc2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。7.multiplecloningsites:多克隆位點(diǎn)：MCS,是包含多個(gè)（最多20個(gè)）限制性酶切位點(diǎn)（restrictionsite）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點(diǎn)接頭（polylinker），往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。8.αComplementary:α互補(bǔ)：Lacz基因編碼的α肽鏈同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突變體的互補(bǔ)現(xiàn)象為α互補(bǔ)。LacⅠ（半乳糖苷酶）有兩個(gè)主要的亞基，α亞基和ω亞基，前者的DNA序列很短，后者比較長。α與ω相結(jié)合就能表現(xiàn)出半乳糖苷酶活性。所以大部分基因工程菌株的基因組上都有ω亞基的序列，但是敲除了α亞基序列，默認(rèn)只表達(dá)ω亞基，不會(huì)有半乳糖苷酶活性。但是如果轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒上有連續(xù)完整的α亞基序列，那么就會(huì)表達(dá)α亞基，產(chǎn)生“α互補(bǔ)”，表現(xiàn)出LacZ活性。9.Recombinant:重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。二、填空（15×1’）1.在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)中，第6步加入Calc2的目的是：洗凈前一步殘留的LB液體，Calc2的目的是：保存細(xì)胞，使其處于感受態(tài)。2.質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)的原理：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA之間在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而達(dá)到分離目的。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實(shí)驗(yàn)中，DNA分子的遷移速率取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。4.Loading-buffer的中文名稱是上樣緩沖液。5.dNTP是dATP、dGTP、dCTP、dTTP的統(tǒng)稱。6.酵母轉(zhuǎn)化的方法主要有三種，分別是醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法（粒子轟擊轉(zhuǎn)化法），其中醋酸鋰的作用是其中的Li+可以中和DNA和細(xì)胞膜脂所帶的負(fù)電荷，同時(shí)它還可以在細(xì)胞膜上形成小的弘道，以便于DNA分子進(jìn)入細(xì)胞，聚乙二醇的作用是能增加細(xì)胞膜的聚集，促進(jìn)DNA分子粘附在細(xì)胞表面，增強(qiáng)轉(zhuǎn)化率。7.在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)中，我們使用的大腸桿菌種名為：DH5α。8.在質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)中，Tris飽和酚、氯仿、異戊醇三種成分的作用分別是使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用、加速有機(jī)相與液相分層、可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生并有助于分相。9.dNTP的中文名稱是三磷酸堿基脫氧核苷酸，dATP、dGTP、dCTP、dTTP的中文名稱分別是三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸。10.DNA重組的方法主要有黏端連接法和平端連接法。11.表達(dá)載體應(yīng)具有的幾種元件包括：選擇標(biāo)記的編碼序列，控制轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)（MCS），控制轉(zhuǎn)錄的終止子和自主復(fù)制序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)。四、簡答題（5×6’）1.簡述SDS電泳技術(shù)檢測蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)步驟？①把玻璃板洗凈后用蒸餾水沖洗，晾干，準(zhǔn)備2個(gè)干凈的小燒杯。②把玻璃板在灌膠支架上固定好。③配置12%分離膠。④按比例配好分離膠，用移液槍快速將分離膠加到玻璃板縫隙中，距短板上沿約2cm加少量蒸餾水，靜置至膠凝固30min。⑤用濾紙把上層的水吸干，按比例配濃縮液，沿邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入至離短板5mm處，迅速插入梳子，靜置到膠凝固，梳子需一次拔出，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。⑥在內(nèi)槽中加入電泳緩沖液，將內(nèi)槽置于外槽內(nèi)，外槽也加電泳buffer。⑦上樣：將各時(shí)間段的樣分別取10μl加到樣孔中，上樣時(shí)記清順序。⑧接通電源：80V恒溫電泳至溴酚藍(lán)注入分離膠，再用160V至溴酚藍(lán)距下邊0.5-1cm停止電泳。⑨撬開玻璃板，剝膠。注意分離膠要完整，做好標(biāo)記后放至有考馬斯亮藍(lán)的培養(yǎng)皿中染2h后，用脫色液脫色（期間更換脫色液2-3次），直到蛋白質(zhì)條帶清晰，觀察結(jié)果并拍照保存。2.酵母表達(dá)載體與一般的細(xì)菌表達(dá)載體有哪些相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？相同點(diǎn)：要經(jīng)過目的基因的獲取，目的DNA片段的擴(kuò)增，載體與目的DNA片段的連接，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后重組子的鑒定。不同點(diǎn)：酵母表達(dá)載體多為穿梭質(zhì)粒載體，并且目的基因DNA片段與T4載體連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后再用酶切目的DNA（5wbp）連接，再用PGBK7EKQ載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定；用于篩選標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類。一般細(xì)菌表達(dá)載體的載體不是穿梭質(zhì)粒載體，并且目的基因DNA片段只需一種載體即可鑒定篩選，一般用藍(lán)白斑篩選原理，比如在羧芐青霉-gal、IPTG的選擇平板上，涂布進(jìn)行篩選。3.簡述質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)中，溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用？溶液Ⅰ：其中的葡萄糖能夠懸浮大腸桿菌、Tris-HCl緩沖液能控制溶液的pH值、EDTA螯合大腸桿菌中的金屬離子。溶液Ⅱ：其中的NaOH堿裂解大腸桿菌的細(xì)胞膜，2%SDS是沉淀劑。溶液Ⅲ：其中的乙酸鉀作用是使沉淀能力更強(qiáng)，冰醋酸是中和多余的氫氧化鈉。4.簡述瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的步驟？1.

將有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗凈晾干，放置于水平制膠器內(nèi)，并架好樣品梳子。2.制膠：配置適宜濃度的瓊脂糖凝膠，準(zhǔn)確稱量0.15g瓊脂糖干粉，放入洗好的錐形瓶內(nèi)，加入15ml0.5×TBE（用量筒量取后，用紙蓋蓋著錐形瓶的口，）放入微波爐內(nèi)加熱融化，然后冷卻片刻，加入1μl核酸染液，混勻，然后倒入架好的有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，待其凝固。3.拔梳子：室溫下20-30min后，有機(jī)玻璃的內(nèi)槽的凝膠形成一層均勻的膠面，小心拔出梳子。4.將有機(jī)玻璃內(nèi)槽連同凝膠拔出，放入電泳槽內(nèi)，向電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液（0.5×TBE），其量以沒過膠面1mm為宜。5.加樣：分別取20μlDNA和20μlloadingbuffer混勻，用移液槍將混勻的樣品緩緩加入點(diǎn)樣孔中（每樣孔7μl）。6.接通電源：紅色為正極，黑色為負(fù)極，DNA樣品由負(fù)極向正極移動(dòng)，一般選擇80V電壓，電泳時(shí)間為30min。7.當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。8.電泳完畢，關(guān)上電源，取出凝膠，在染色體投射儀下，觀察結(jié)果。5.簡述聚合酶鏈反應(yīng)的原理和過程？原理：類似于DNA的天然復(fù)制過程。反應(yīng)體系為：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。包括高溫變性（94℃）、低溫復(fù)性（50-60℃）、中溫延伸（72℃）三個(gè)過程。1.根據(jù)模板，設(shè)計(jì)引物。2.在0.2PCR管內(nèi)配置25μ反應(yīng)體系：2.5mmol/LdNTP混合物2μl10×PCRbuffer2.5μl正向引物1μl反向引物1μl模板DNA0.5μlTaq聚合酶0.5μl雙蒸水17.5μl3.根據(jù)條件，設(shè)計(jì)PCR程序，進(jìn)行擴(kuò)增。①94℃預(yù)變性5min②94℃變性30s③55℃退火30s④72℃延伸1min⑤重復(fù)②③④30次⑥72℃總延伸5min4.瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果1%瓊脂糖凝膠，25μlPCR產(chǎn)物+3μlloadingbuffer，點(diǎn)6個(gè)孔。第一個(gè)孔加3μlmaker，后5個(gè)各點(diǎn)5μl產(chǎn)物。7.藍(lán)白斑篩選的原理的什么？原理:任何攜帶β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體基因組中中存在這種β-半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，便會(huì)產(chǎn)生有功能活性的β-半乳糖苷酶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在含有X-gal的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落；而當(dāng)外源DNA片段插入到LacⅠ’中的多克隆位點(diǎn)后，就會(huì)破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β-半乳糖苷酶互補(bǔ)的活性α肽，而導(dǎo)致不能形成有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色的。8.pET系列的原核表達(dá)載體中外源基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的原理是什么？當(dāng)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子即可被誘導(dǎo)在這個(gè)操縱子系列中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身，而是半乳糖，后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與0序列解離發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖（IPTG）是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定。因此，被廣泛用作乳糖操縱子模型的誘導(dǎo)劑。pET原核表達(dá)載體中，T7啟動(dòng)子下游有一個(gè)lac操縱子序列，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化帶有染色體T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌中，在培養(yǎng)基系列中加入IPTG誘導(dǎo)T7RNA聚合酶生產(chǎn)，繼而質(zhì)粒上的目的DNA開始轉(zhuǎn)錄。9.酵母lacZ報(bào)告基因的檢測方法有哪些？其中l(wèi)acZ報(bào)告基因酶活性檢測的原理是什么？檢測方法：酶活性檢測原理：ONPG（2-硝基-β-D-吡喃半乳糖苷）為無色物質(zhì)，在β-半乳糖苷酶的作用下可被水解為半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚（ONP），因此可以通過培養(yǎng)液顏色變化在410-420nm波長處測知β-半乳糖苷酶的活性。10.酵母表達(dá)載體篩選標(biāo)記的類型有哪些？結(jié)合每種類型的篩選標(biāo)記，簡單舉例說明酵母表達(dá)載體篩選標(biāo)記是如何發(fā)揮作用的。類型有：營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩類。①互補(bǔ)基因：如Leu,TRP等，像leu營養(yǎng)缺陷型，當(dāng)連接目的DNA片段的載體轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，能使載體片段上編碼leu合成基因表達(dá)，那此時(shí)轉(zhuǎn)化后的酵母表達(dá)載體感受態(tài)細(xì)胞不需要培養(yǎng)基中加入leu即可生長。②顯性基因編碼產(chǎn)物主要是顯性物質(zhì)的抗性蛋白，如Cph,cat等，即載體有cph等抗性基因與目的DNA連接導(dǎo)入酵母感受態(tài)細(xì)胞后，能產(chǎn)生抗cph，即在含cph的培養(yǎng)基中能生長，即達(dá)到篩選的目的。五、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（2×15’）1.請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，純化PUC-18質(zhì)粒雙酶切后的產(chǎn)物。①100μlPCR產(chǎn)物補(bǔ)水至200μl，加等體積的Tris飽和酚：氯仿：異戊醇，漩渦混勻，12000r/min離心5min，取上清（約120μl）②加等體積氯仿：異戊醇，漩渦混勻，12000r/min離心5min，取上清（約100μl）③加等體積無水乙醇（冰上預(yù)冷）和1/10體積3M醋酸鈉（pH5.2），充分混勻，沉淀DNA④手動(dòng)短時(shí)離心3-5s，冰上沉淀30min⑤12000r/min離心10min，棄上清⑥用200μl70%乙醇洗滌沉淀1次（12000r/min），棄上清，空中干燥⑦加入20μlTE，溶解⑧電泳檢測3.如何確定一種新細(xì)菌中是否含有質(zhì)粒？設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，提取已知細(xì)菌中的質(zhì)粒？判斷細(xì)菌中是否含有質(zhì)粒的方法：①抗氨芐青霉素等抗性基因的篩選；②直接提取總的DNA，然后電泳酶帶；③用已知同種屬或近似屬含質(zhì)粒或不含質(zhì)粒的菌株作對(duì)照試驗(yàn)提取質(zhì)粒的方法：①先在3mlLB液體培養(yǎng)基中加入3μl羧芐青霉素（終濃度為50μg/mol），然后接入一個(gè)含PUC-18質(zhì)粒的DH5α單菌落，37℃震蕩過夜培養(yǎng)②將過夜培養(yǎng)的菌液加入1.5ml至離心管中，4000r/min離心1min，吸去培養(yǎng)液，將所有菌體細(xì)胞收集于離心管中③加入100μl溶液Ⅰ于各菌體細(xì)胞的離心管中，漩渦震蕩將細(xì)菌沉淀懸浮，室溫放置10min④加入200μl溶液Ⅱ（新配置）輕輕混勻內(nèi)容物，溶液逐漸變清后加入溶液Ⅲ（千萬不要用漩渦振蕩器，裂解時(shí)間不要超過5min）⑤加入150μl溶液Ⅲ（冰上遇冷）蓋緊管口，輕輕混勻數(shù)次，冰上放置15min，使質(zhì)粒DNA復(fù)性（顛倒混勻）⑥12000r/min離心10min，將上清轉(zhuǎn)至另一1.5ml離心管中⑦向上清中加入等體積的氯仿：異戊醇，渦旋混勻，12000r/min離心5min，吸取上清液⑧向上清中加入等體積的氯仿：異戊醇，渦旋混勻，12000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液⑨向上清中加入2倍體積無水乙醇，漩渦混勻，室溫放置30min，12000r/min，離心10min，棄上清⑩用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀1次，12000r/min離心5min，棄上清，空中干燥。?加入20μlTE緩沖液，使質(zhì)粒DNA完全溶解，-20℃保存?，F(xiàn)已知基因A編碼區(qū)序列信息，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，將A基因克隆到表達(dá)載體中。4.現(xiàn)已知一個(gè)基因編碼區(qū)的序列信息，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，將該基因克隆到表達(dá)載體中。基因克隆實(shí)驗(yàn)的過程：獲得基因序列：通過RT-PCR或基因組數(shù)據(jù)庫獲得→引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增目的片段→PCR產(chǎn)物連接到載體上構(gòu)建重組載體→重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增或表達(dá)蛋白①設(shè)計(jì)引物以該基因cDNA為模板，對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。②回收目的基因DNA片段。③將目的DNA片段與T載體（PGEM-T）進(jìn)行連接（16℃，15h）④將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞涂布PAMP抗性平板。⑤對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定（PCR，質(zhì)粒酶切，測定）。⑥選取一個(gè)鑒定序列正確的轉(zhuǎn)化子，接入20μl含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，220rm37℃液體培養(yǎng)，提質(zhì)粒⑦用EcoRⅠ和HamHⅠ酶切步驟⑥中提取的質(zhì)粒，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，然后用凝膠回收試劑盒回收目的基因。⑧用HamHⅠ酶切載體EQ（37℃，6h左右）酶切后上樣loadingbuffer進(jìn)行凝膠電泳切下目的載體條帶，用凝膠回收試劑盒回收酶切后的載體，記為PGBKT7EBQ。⑨連接：將步驟⑦中回收的DNA片段與PGBKT7EBQ通過T4DNA連接。⑩篩選轉(zhuǎn)化子，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞涂布含Kna的LB平板，37℃過夜。?對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，陽性轉(zhuǎn)化子可用于轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。三、判斷題1.SDS的中文名稱是十二烷基硫酸鉀。（×）2.PCR反應(yīng)中，經(jīng)歷高溫變性、中溫退火、低溫延伸三個(gè)階段。（×）3.DNA連接酶和DNA聚合酶相同點(diǎn)是都能連接磷酸二酯鍵。（√）4.大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)中，加入溶液2后，冰上保溫30min。（×）5.制作DNA瓊脂糖凝膠時(shí)，應(yīng)加入1μl核酸染液。（√）6.質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)中，溶液1中的葡萄糖可以用水替代。（×）7.真核生物的基因組DNA可以用