重要病原體變異規(guī)律與致病機(jī)制研究論文

項目名稱：重要病原體變異規(guī)律與致病機(jī)制研究首席科學(xué)家：起止年限：依托部門：

二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)以病原體變異與流行規(guī)律及致病機(jī)制這兩個關(guān)鍵科學(xué)問題為核心，充分利用我國流行菌株和臨床樣本資源，發(fā)揮學(xué)科間交流與合作的優(yōu)勢，采用現(xiàn)代前沿組學(xué)、生物信息學(xué)、感染性克隆等先進(jìn)技術(shù)，從病原學(xué)、流行病學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、疫苗學(xué)等角度，深入揭示志賀氏菌、EV71等腸道病毒、腦膜炎奈瑟菌三種病原體引起的疾病的本質(zhì)，了解其變異、流行規(guī)律、致病機(jī)理和機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制，并研制出有可能應(yīng)用于臨床防治的新型疫苗和診斷新技術(shù)，為臨床救治方案的制訂、疫苗的研發(fā)、藥物靶標(biāo)的篩選及防控策略的完善等提供理論基礎(chǔ)。通過課題的實施，培養(yǎng)一批優(yōu)秀人才，全面提升我國相關(guān)傳染病診防治的整體水平。五年預(yù)期目標(biāo)1、深入揭示志賀氏菌變異規(guī)律和致病機(jī)制。包括系統(tǒng)分析志賀氏菌的進(jìn)化起源和變異機(jī)制；部分闡明福氏志賀菌血清型轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律及其對福氏志賀氏菌流行強(qiáng)度的影響；了解福氏志賀氏菌優(yōu)勢血清型菌株的耐藥、致病力和環(huán)境適應(yīng)能力特點；揭示毒力大質(zhì)粒對宿主菌染色體基因表達(dá)影響的種類與方式；了解志賀氏菌毒力相關(guān)蛋白下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的現(xiàn)象和在宿主細(xì)胞中的作用靶點及新的作用方式。2、揭示我國EV1等變異規(guī)律、趨勢及其與毒力關(guān)系。包括闡明過去10年我國大陸流行的EV71病毒的型別特點和進(jìn)化特征；闡明若干與病毒毒力有關(guān)的變異位點，鑒別出一組與病毒復(fù)制和翻譯有關(guān)的宿主因子，并部分闡明其作用機(jī)制；解析若干EV71變異體病毒顆粒和3C、3D等重要功能蛋白及其突變體的結(jié)構(gòu)；建立我國EV71毒株庫，建立感染性克隆、亞基因組復(fù)制子等關(guān)鍵性研究技術(shù)平臺；3、部分闡明EV71等病毒的致病與免疫機(jī)制。包括揭示EV71侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制；部分闡明EV71拮抗天然免疫、誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的機(jī)制及其與EV71及疾病進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系，提出EV71滅活疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制和有效性評價指標(biāo)；建立完善用于EV71感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等。4、初步揭示腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機(jī)制。包括掌握我國主要腦膜炎奈瑟菌流行菌株血清群變異的規(guī)律；了解我國腦膜炎奈瑟菌菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴(kuò)散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；初步闡明了解細(xì)菌的粘附和侵襲毒力基因和蛋白的相互關(guān)系。5、培養(yǎng)中青年研究骨干30人以上，研究生50-80名。6、在SCI收錄雜志上發(fā)表論文80-100篇。

三、研究方案（一）總體學(xué)術(shù)思路本項目圍繞病原體變異規(guī)律與致病機(jī)制這兩個傳染病基礎(chǔ)研究中的核心科學(xué)問題，根據(jù)我國傳染病防控的需求，以志賀氏痢疾桿菌、EV71等腸道病毒和腦膜炎奈瑟菌等為研究對象，利用前沿組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等各種前沿生命組學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)、感染性克隆、基因工程動物等先進(jìn)技術(shù)，從病原學(xué)、流行病學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、疫苗學(xué)等角度，在病原體基因及其編碼產(chǎn)物、宿主分子、細(xì)胞、動物和機(jī)體等不同層次上，深入揭示志賀氏菌、EV71等腸道病毒、腦膜炎奈瑟菌等變異規(guī)律及其與致病機(jī)制關(guān)系，同時根據(jù)病原體的不同各有側(cè)重：――志賀氏菌以優(yōu)勢血清型和編碼噬菌體為重點，研究優(yōu)勢血清型菌株的致病性、流行性、耐藥性等生物學(xué)特性，提出解釋我國福氏志賀氏菌流行病學(xué)特點的假說，為發(fā)展志賀氏菌疫苗和控制志賀氏菌感染提供新的思路和策略。――手足口病圍繞EV71等腸道病毒遺傳變異和致病機(jī)制兩大科學(xué)問題，開展EV71等腸道病毒遺傳變異規(guī)律及其與毒力關(guān)系、病毒致病與免疫保護(hù)機(jī)制的研究，為病毒監(jiān)測、臨床救治、疫苗研發(fā)和藥靶篩選等提供基礎(chǔ)科技支撐，填補(bǔ)研究空白。――腦膜炎耐瑟菌重點闡明我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴(kuò)散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；同時，開展莢膜合成基因簇的表達(dá)、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組的調(diào)控機(jī)制研究，以期了解我國流腦菌株血清群變異的機(jī)制和規(guī)律，甄別流腦流行株和非流行株，為我國流腦預(yù)防控制提供基礎(chǔ)性參考數(shù)據(jù)。（二）技術(shù)路線1、志賀氏菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究本課題將收集和分離志賀氏菌流行株，分析其血清型、耐藥性、生化特性、毒力等，選擇具有代表性菌株，通過全基因序列分析以及比較基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)不同血清型、耐藥性、毒力及生化特性等菌株的基因組差異，重點研究各種志賀氏菌菌株之間致病性質(zhì)粒、毒力島、血清型轉(zhuǎn)換噬菌體等可水平轉(zhuǎn)移遺傳成分以及與生存環(huán)境相關(guān)的代謝基因間的差異，并進(jìn)一步通過噬菌體分離、基因敲除、基因?qū)搿游锒玖υu價等分析上述差異與致病力的關(guān)系，同時開展志賀氏菌致病性質(zhì)粒與染色體的協(xié)同進(jìn)化研究、重要毒力蛋白和復(fù)合物與宿主相互作用，系統(tǒng)解析志賀氏菌的變異規(guī)律與致病性的關(guān)系。2、EV71等病毒變異趨勢與毒力關(guān)系的研究（1）我國不同地區(qū)EV71等病毒流行變異規(guī)律研究：收集1998-2009年我國不同地區(qū)的EV71分離株，利用基因組步移(genomewalking)、PCR和RACE技術(shù)等擴(kuò)增并測定病毒全基因組序列。以發(fā)表毒株序列為參考序列，應(yīng)用比較基因組學(xué)等方法進(jìn)行EV71等病毒遺傳進(jìn)化樹，探明我國EV71病毒的型別特點、分子特征和衍化來源。闡明中國大陸流行的EV71病毒的基因變異規(guī)律及病毒基因型別進(jìn)化，闡明不同毒株在不同基因之間的進(jìn)化關(guān)系和病毒衍化來源。（2）EV71等病毒變異與病毒毒力關(guān)系研究：通過對不同地區(qū)、不同毒力的EV71分離株進(jìn)行序列比對，利用定點突變技術(shù)，在EV71基因組中引入突變位點，轉(zhuǎn)錄出RNA后轉(zhuǎn)染敏感宿主細(xì)胞，觀察重組病毒的產(chǎn)生效率和噬斑形成能力等，確定EV71變異與毒力的關(guān)系，并在動物模型上進(jìn)一步驗證。在此基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞表達(dá)、純化重組EV71突變體蛋白或病毒樣顆粒，優(yōu)化條件，最終獲得質(zhì)量符合X射線衍射實驗的單晶體，結(jié)合實驗室小型X射線衍射儀，大型同步輻射實驗室獲得EV713C衍射數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和三維模型建立，完成結(jié)構(gòu)解析。以EV71蛋白和非編碼區(qū)RN1為釣餌，利用親和層析、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析鑒別與EV71基因組非編碼區(qū)及RNA依賴的RNA聚合酶結(jié)合的宿主因子，并研究其相互作用機(jī)制及其對病毒復(fù)制的影響。具體思路如圖2所示。3、EV71等病毒致病與免疫保護(hù)機(jī)制研究（1）EV71等致病機(jī)制研究：建立血腦屏障模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、動物學(xué)等技術(shù)體系，進(jìn)行血腦屏障侵入路線同神經(jīng)軸突侵入路線的功能性比較研究、篩選和鑒定參與不同EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)路線的相關(guān)作用因子，揭示神經(jīng)毒性分子機(jī)制研究，從而闡明EV71的神經(jīng)嗜性機(jī)制。利用免疫沉淀、報告基因轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組組學(xué)、酵母雙雜交篩選、RNAi等技術(shù)闡明宿主天然免疫系統(tǒng)對EV71的識別機(jī)制，病毒對干擾素等天然免疫系統(tǒng)的拮抗機(jī)制；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)等建立EV71的小鼠敏感感染模型，利用該模型觀察天然免疫與EV71致病性的關(guān)系及干擾素的治療作用。（2）手足病免疫保護(hù)機(jī)制研究：利用流式細(xì)胞分析和液態(tài)芯片檢測、微量中和實驗等技術(shù)，動態(tài)研究臨床患者不同病程免疫應(yīng)答特征，了解重要免疫細(xì)胞、免疫因子與病情發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的功能關(guān)聯(lián)性；利用超速離心、流式細(xì)胞分析、電鏡檢測、芯片分析以及高通量熒光定量PCR等方法探索EV71等病毒感染機(jī)體后不同免疫細(xì)胞間快速致病信息交流的機(jī)制；利用小鼠模型觀察CD4T細(xì)胞與EV71致病性及疾病進(jìn)展的關(guān)系；制備EV71滅活疫苗，免疫恒河猴，觀察猴體病理反應(yīng)以及細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)；用EV71進(jìn)行攻擊，觀察病理反應(yīng)和保護(hù)作用及病毒排泌情況等，力爭進(jìn)入臨床試驗，觀察疫苗安全性和有效性，提出評價疫苗安全性和有效性的指標(biāo)。4、腦膜炎奈瑟菌變異與流行規(guī)律及致病機(jī)制研究針對流行性腦膜炎，本項目擬通過體外粘附侵襲實驗、基因組序列測定、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和RNA測序手段分析具有不同流行特征的流腦菌株在致病性上的差異及其可能的產(chǎn)生機(jī)制。（三）創(chuàng)新性本項目以志賀氏菌、EV71等腸道病毒和腦膜炎奈瑟菌等為研究對象，開展系統(tǒng)研究，具有很強(qiáng)的創(chuàng)新性：1、從血清型轉(zhuǎn)換噬菌體入手，研究噬菌體感染的特異性和時序性，揭示噬菌體與福氏志賀菌血清變遷的關(guān)系，對于預(yù)測、預(yù)警流行血清型及血清型變化趨勢，闡明細(xì)菌性痢疾的流行規(guī)律具有重要意義。2、目前手足口病的基礎(chǔ)研究在國內(nèi)外均非常薄弱，空白很多，本研究均為原始創(chuàng)新研究。其中擬開展的我國大陸流行的EV71等腸道病毒的變異規(guī)律和毒力關(guān)系研究以及致病機(jī)制和免疫保護(hù)機(jī)制的研究，如EV71變異與毒力關(guān)系、EV71病毒顆粒與重要蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)、EV71侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其致?lián)p傷機(jī)制、天然免疫拮抗機(jī)制、獲得性免疫與疾病進(jìn)程關(guān)系、EV71滅活疫苗保護(hù)機(jī)制等重要研究方向均未見系統(tǒng)研究。建立新型小鼠感染模型和恒河猴模型將對闡明EV71滅活疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制和有效性評估提供重要理論依據(jù)。3、充分利用我國腦膜炎奈瑟菌資源，研究不同來源菌株流行變異規(guī)律及粘附侵襲相關(guān)基因蛋白調(diào)控機(jī)制。從分子水平上解釋細(xì)菌的粘附侵襲相關(guān)因子和健康人群的正常攜帶對流腦流行傳播的規(guī)律的影響，了解我國不同流行特征的腦膜炎奈瑟菌在致病能力上的差異。系統(tǒng)研究和了解我國不同血清群菌株血清群變異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制。（四）研究特色1、在志賀氏菌研究方面：發(fā)達(dá)國家對志賀氏菌的研究，重點已經(jīng)轉(zhuǎn)移到痢疾志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌。我國志賀氏菌研究團(tuán)隊，多年來一直開展福氏志賀氏菌的研究，在基因組解析、進(jìn)化理論、O抗原多樣性形成機(jī)制解析、新的血清型發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)組分析等方面，達(dá)到國際水平。本課題是繼續(xù)以福氏志賀氏菌為主要研究對象開辟新的領(lǐng)域，具有中國特色：（1）從旁基因組和核心基因組兩方面著手，全面分析志賀氏菌分化中發(fā)生的遺傳事件，特別是研究突變和重組對志賀氏菌進(jìn)化的影響。（2）將建立第一個福氏志賀氏菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體庫，進(jìn)而與福氏志賀氏菌的優(yōu)勢血清型的流行結(jié)合研究，探討血清型轉(zhuǎn)換通路，了解新的血清型產(chǎn)生機(jī)制。2、在EV71等病毒研究方面：本項目圍繞我國手足口病防控中急需解決的瓶頸難題，結(jié)合國際前沿進(jìn)展，以病原體變異和致病機(jī)制為主線，開展EV71病毒遺傳變異規(guī)律及其與毒力關(guān)系以及EV71等病毒復(fù)制、致病與免疫保護(hù)機(jī)制的研究。研究內(nèi)容系統(tǒng)全面，包括EV71遺傳變異特征、變異與毒力關(guān)系、復(fù)制機(jī)制、神經(jīng)嗜性機(jī)制、免疫調(diào)制機(jī)制、疫苗保護(hù)機(jī)制和動物模型等，涵蓋了病毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)、病理學(xué)等諸多領(lǐng)域，是迄今為止最為全面的研究，填補(bǔ)多方面空白。課題綜合運用了蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等前沿組學(xué)，感染性克隆技術(shù)，免疫學(xué)，基因工程動物模型技術(shù)，生物信息學(xué)技術(shù)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)，體現(xiàn)了傳染病和病毒學(xué)研究的國際前沿水平。另外，針對不同地區(qū)EV71流行特征不同，本研究是基于對我國內(nèi)地EV71流行變異規(guī)律分析基礎(chǔ)上，利用我國毒株進(jìn)行的，具有我國特色。3、在腦膜炎奈瑟菌研究方面：全球范圍內(nèi)，流腦的流行具有地區(qū)性或區(qū)域性，不同地區(qū)各有特點，流腦疫苗的應(yīng)用影響到流腦流行和傳播的規(guī)律。國際上的研究各有側(cè)重。本研究集中國內(nèi)流腦研究的優(yōu)勢單位，利用現(xiàn)有的近50年來的不同時期的流腦菌株，對這些菌株進(jìn)行致病性和變異性研究，有助于我們更好地了解和掌握中國流腦流行規(guī)律的變遷和菌株的變異流行規(guī)律和菌株的毒力特征，為我國流腦的防控和流行預(yù)測提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。（五）可行性分析1、理論上可行：本研究所涉及的痢疾變異規(guī)律、EV71遺傳變異特征、變異與毒力關(guān)系、致病和免疫保護(hù)機(jī)制和動物模型的研究、腦膜炎奈瑟菌等變異規(guī)律和致病機(jī)制等研究均基于國際相關(guān)領(lǐng)域的最新進(jìn)展，在其他病原體有成功經(jīng)驗可循，部分研究已經(jīng)取得初步成果。2、具有資源優(yōu)勢：研究團(tuán)隊中的中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所新病原室，長期從事細(xì)菌性痢疾等細(xì)菌性腹瀉病的研究，是國家細(xì)菌性痢疾監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)菌株收集、鑒定和保藏單位，已經(jīng)收集和保存不同年代、不同地區(qū)、不同血清型痢疾桿菌4000余株，其中福氏志賀菌2000余株，涵蓋目前已知的15個血清型。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物研究所、中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所等單位分離、收集了EV71毒株600余株，研究單位和北京地壇醫(yī)院以及多個省級疾控中心建立了良好合作關(guān)系，可獲得研究所需臨床樣本，另外研究所需的細(xì)胞株、克隆、細(xì)胞系、抗體等均已收集齊備；中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道病原保存有近50年來的不同時期的流腦菌株和樣本，保存有我國自1956年以來腦膜炎奈瑟菌菌株3000多株，這些菌株能夠代表建國以來我國流腦流行期間以及流行間期腦膜炎奈瑟菌菌株的整體狀況。另外，通過購買或者國際交流與合作，還獲得了世界其它流腦流行國家、地區(qū)的腦膜炎奈瑟菌代表株。3、具有成熟的技術(shù)平臺：研究團(tuán)隊的中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和南開大學(xué)團(tuán)隊已投資建成了具備國際通行標(biāo)準(zhǔn)的基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)研發(fā)平臺，為計劃的實施奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所團(tuán)隊（病原微生物生物安全國家重點實驗室），建立了微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺，并且熟練掌握了進(jìn)行毒力評價研究的多種方法和模型。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所建立了基因工程動物模型技術(shù)平臺、醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所建立了靈長類動物平臺，均可為本項目的開展提供支撐。本研究所需各類實驗技術(shù)均已被研究團(tuán)隊熟練掌握，并具備研究所需的生物安全二級實驗室等保障條件，開展本研究不存嚴(yán)重技術(shù)障礙。4、具有高素質(zhì)的研究團(tuán)隊：本項目集成了來自重大疾病研究國家實驗室（籌）以及病毒基因工程、病毒學(xué)、傳染病預(yù)防控制、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)、病原微生物生物安全等五個國家重點實驗室等的高水平科研力量，擁有國內(nèi)痢疾、手足口病和流腦等研究最強(qiáng)的研究隊伍，部分骨干參與了本項目前兩期的研究，具有良好的工作基礎(chǔ)，為本項目的完成提供了重要保障。（六）課題設(shè)置課題設(shè)置思路：本項目繼續(xù)圍繞病原體變異規(guī)律與致病機(jī)制這兩個傳染病基礎(chǔ)研究中的核心科學(xué)問題，根據(jù)我國傳染病防控需求，選擇四種重要病原體分別研究其變異規(guī)律及其與致病機(jī)制的關(guān)系，包括現(xiàn)階段居于我國傳染病發(fā)病率前列的痢疾、手足口病以及流行型別和模式發(fā)生轉(zhuǎn)變、對社會造成嚴(yán)重沖擊的流腦等重要傳染病的病原體，其中以手足口病和痢疾為研究重點。圍繞項目的科學(xué)問題、主要研究內(nèi)容和目標(biāo)，擬設(shè)置“志賀氏菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究”、“EV71等病毒變異與毒力關(guān)系的研究”、“EV71等病毒致病與免疫機(jī)制研究”和“腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究”四個課題。為突出重點，其中考慮到我國當(dāng)前手足口病研究基礎(chǔ)薄弱，國內(nèi)以前對相關(guān)研究資助較少，而近年疫情上升迅猛，國內(nèi)外普遍關(guān)注，特設(shè)置兩個課題，以加強(qiáng)相關(guān)研究；痢疾研究基礎(chǔ)較好，單獨設(shè)置一個課題；流腦單獨設(shè)置一個課題。課題間的聯(lián)系及其與項目目標(biāo)的關(guān)系：本項目的4個課題分別針對志賀氏菌、EV71等病毒和腦膜炎奈瑟菌開展研究，都是圍繞病原體變異規(guī)律和致病機(jī)制關(guān)系展開，涵蓋細(xì)菌、病毒等不同微生物，相關(guān)研究將從不同側(cè)面顯示病原體的變異特征、導(dǎo)致疾病本質(zhì)和相關(guān)機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)、揭示共性問題和規(guī)律，從而從整體上提高我們對于傳染病的認(rèn)識，因此這4個課題是圍繞項目目標(biāo)的有機(jī)統(tǒng)一的整體。其中課題2和3從病毒變異和致病機(jī)制兩個方面對EV71進(jìn)行研究，但又各有側(cè)重，這兩個課題的研究成果結(jié)合起來將對手足口病的臨床診治、預(yù)防控制、疫苗和藥物研發(fā)等提供基礎(chǔ)。課題1：志賀氏菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究主要研究內(nèi)容：（1）志賀氏菌O抗原的變異規(guī)律的研究通過對不同福氏志賀氏菌血清型亞型的全基因組分析，找到負(fù)責(zé)特定血清型亞型形成的關(guān)鍵基因。解析不同福氏志賀氏菌血清型的分化機(jī)制，了解不同血清型之間轉(zhuǎn)化的變異機(jī)制，建立針對全部福氏志賀氏菌血清型的分子分型方法，為針對福氏志賀氏菌的傳染病防控和疫苗開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。針對志賀氏菌“多起源”和變異程度高的特點，通過志賀氏菌及其潛在的前體—侵襲性大腸桿菌（EIEC）之間的比較基因組學(xué)分析，建立志賀氏菌和EIEC的旁基因組（Pan-genome）數(shù)據(jù)庫和核心基因組（core-genome）數(shù)據(jù)庫，對志賀氏菌的進(jìn)化起源機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析，了解其進(jìn)化和變異的規(guī)律和趨勢。（2）福氏志賀氏菌優(yōu)勢血清型轉(zhuǎn)換噬菌體和流行強(qiáng)度的研究通過誘導(dǎo)、獲取目前已知和未知的各種福氏志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體，對目前全基因組序列未知的噬菌體進(jìn)行序列測定和生物學(xué)特征研究；研究不同血清型轉(zhuǎn)換噬菌體單獨或組合感染及轉(zhuǎn)化福氏志賀菌的可能性和特異性，掌握多種噬菌體組合感染的時序性，了解福氏志賀菌血清型間轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律；研究各種噬菌體單獨或組合感染時在宿主菌基因組上的整合位點和排列方式，為揭示福氏志賀菌血清型間轉(zhuǎn)換及遺傳進(jìn)化的分子機(jī)制提供線索；揭示血清轉(zhuǎn)換噬菌體與福氏志賀菌血清變遷的關(guān)系，闡明福氏志賀菌血清型變遷機(jī)制。（3）志賀氏菌毒力大質(zhì)粒和染色體的協(xié)同進(jìn)化及調(diào)控毒力大質(zhì)粒的獲得是志賀氏菌從非致病性大腸桿菌變?yōu)橹虏【牡谝徊揭彩亲钪匾囊徊?，隨后志賀氏菌的染色體與大質(zhì)粒就開始了漫長的協(xié)同進(jìn)化歷程，以達(dá)到其適應(yīng)腸道新環(huán)境的最佳狀態(tài)。本研究擬通過比較不同血清型志賀氏菌去除毒力大質(zhì)粒前后、非致病性大腸桿菌導(dǎo)入毒力大質(zhì)粒前后的蛋白表達(dá)譜和復(fù)合物譜的變化，從全局角度對志賀氏菌毒力大質(zhì)粒與染色體之間的關(guān)系進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，以期發(fā)現(xiàn)一些新的抗毒力基因和解析志賀氏菌毒力大質(zhì)粒對染色體表達(dá)調(diào)控的全新機(jī)制，極大地豐富細(xì)菌質(zhì)粒與染色體協(xié)同進(jìn)化理論的內(nèi)容，也為致病菌的致病性研究提供了借鑒。（4）福氏志賀氏菌重要蛋白復(fù)合物、毒力蛋白和耐藥性研究基于志賀氏菌感染機(jī)體后通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)釋放的毒力蛋白調(diào)控各種炎癥反應(yīng)信號通路，能夠下調(diào)宿主的免疫應(yīng)答，但其調(diào)控過程中的具體機(jī)制尚不明確。本研究主要以此類毒力蛋白和重要蛋白復(fù)合物參與介導(dǎo)的志賀氏菌致病機(jī)制展開研究。針對Ⅲ型分泌系統(tǒng)釋放的毒力蛋白在志賀氏菌感染中能下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的現(xiàn)象，尋找其在宿主細(xì)胞中的作用靶點，研究毒力相關(guān)蛋白和其它重要功能蛋白參與調(diào)控宿主相關(guān)免疫信號途徑的新作用方式，以幫助我們理解志賀氏菌的致病機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)抗痢疾小分子藥物提供理論基礎(chǔ)和線索。在耐藥分子機(jī)制研究方面，通過基因芯片技術(shù)平臺，從志賀氏菌全基因組和轉(zhuǎn)錄組水平高通量、全方位篩選耐藥相關(guān)基因和系統(tǒng)研究志賀氏菌耐藥的分子機(jī)制及調(diào)控機(jī)理；通過分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和功能基因組學(xué)方法研究耐藥相關(guān)基因的功能和遺傳特征，分析和評價耐藥相關(guān)基因在志賀氏菌耐藥性產(chǎn)生過程中所發(fā)揮的作用。主要研究內(nèi)容包括志賀氏菌耐藥株的誘導(dǎo)、分離和鑒定；志賀氏菌全基因組芯片制備；耐藥株與敏感株基因組結(jié)構(gòu)差異分析；耐藥株與敏感株轉(zhuǎn)錄組差異分析；潛在耐藥相關(guān)基因功能和遺傳特征分析。全面研究和評價志賀氏菌耐藥和多重耐藥產(chǎn)生過程中獲得耐藥性的主要方式及分子機(jī)理，從而為臨床耐藥監(jiān)測和開發(fā)針對耐藥菌的新型抗菌藥物提供潛在的分子靶位。同時，通過生物信息學(xué)分析與分子生物學(xué)實驗相結(jié)合的手段，在前期小RNA相關(guān)工作的基礎(chǔ)之上開展毒力大質(zhì)粒上小RNA的功能研究。課題目標(biāo)：（1）建立志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌（EIEC）的旁基因組（Pan-genome）數(shù)據(jù)庫和核心基因組（core-genome）數(shù)據(jù)庫，對進(jìn)化起源和變異機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析；（2）建立福氏志賀氏菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體庫，了解福氏志賀氏菌血清型轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律，以及對福氏志賀氏菌流行強(qiáng)度的影響；（3）了解福氏志賀氏菌優(yōu)勢血清型菌株的耐藥、致病力和環(huán)境適應(yīng)能力特點；（4）了解毒力大質(zhì)粒對宿主菌染色體基因表達(dá)影響的種類和方式；（5）了解志賀氏菌毒力相關(guān)蛋白下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的現(xiàn)象，和在宿主細(xì)胞中的作用靶點和新作用方式；（6）培養(yǎng)中青年研究骨干5-10人，博士后、研究生10-15名；（7）發(fā)表SCI論文25篇以上。承擔(dān)單位：中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室南開大學(xué)分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室課題負(fù)責(zé)人：徐建國，研究員，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：楊劍，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室孫強(qiáng)正，副研究員，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室衛(wèi)燦東，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室朱力，副研究員，病原微生物生物安全國家重點實驗室劉斌，副教授，教育部分子微生物學(xué)與技術(shù)重點實驗室經(jīng)費比例：29.55%。課題2：EV71等病毒變異與毒力關(guān)系的研究主要研究內(nèi)容：（1）我國不同地區(qū)EV71流行變異規(guī)律研究對1998-2009年分離的近500個中國流行株開展系統(tǒng)的分子流行病學(xué)研究，闡明中國大陸流行的EV71病毒的基因變異規(guī)律及病毒基因型別在地域和年代上的分布，以及病毒重要中和抗原位點的變異情況，通過生物信息學(xué)分析尋找潛在的毒力相關(guān)變異，為疫苗和診斷試劑研究等提供依據(jù)。（2）EV71變異與病毒毒力關(guān)系研究對不同地區(qū)EV71分離株體外細(xì)胞感染和體內(nèi)動物感染的不同特性進(jìn)行分析比較，通過構(gòu)建一系列的突變重組病毒，鑒定影響EV71神經(jīng)毒力的關(guān)鍵位點。在上述研究的基礎(chǔ)上，選擇1-2個具有代表性的突變體進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，了解突變對病毒顆粒表面結(jié)構(gòu)的影響，探討病毒變異導(dǎo)致抗原性改變的機(jī)制；挑選2-3個代表性的重要功能蛋白，如3C，3D蛋白突變體進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，為揭示病毒變異導(dǎo)致功能和毒力變異機(jī)制提供基礎(chǔ)；利用EV71亞基因組復(fù)制子探索在神經(jīng)細(xì)胞中復(fù)制的機(jī)理，揭示病毒基因組非編碼區(qū)及RNA依賴的RNA聚合酶、宿主蛋白的相互作用對RNA復(fù)制的影響，鑒別出與病毒復(fù)制密切相關(guān)的宿主因子。課題目標(biāo)：（1）闡明1998-2009年我國大陸流行的EV71病毒的型別特點和進(jìn)化特征；（2）闡明若干與病毒毒力有關(guān)的變異位點，獲得無神經(jīng)毒力重組病毒；（3）解析若干EV71變異體病毒顆粒和3C、3D等重要功能蛋白及其突變體的結(jié)構(gòu)；（4）鑒別出一組與病毒復(fù)制和翻譯有關(guān)的宿主因子，并部分闡明其作用機(jī)制；（5）建立我國EV71毒株庫，建立感染性克隆、亞基因組復(fù)制子等關(guān)鍵性研究技術(shù)平臺；（6）培養(yǎng)中青年科研骨干5-10人，博士后、研究生15-20人；（7）在SCI收錄雜志上發(fā)表論文25篇以上。承擔(dān)單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒基因工程國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室解放軍第302醫(yī)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室課題負(fù)責(zé)人：許文波，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：彭小忠，研究員，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室貌盼勇，研究員，解放軍第302醫(yī)院崔勝，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室周世力，教授，江漢大學(xué)經(jīng)費比例：21.02%。課題3：EV71等病毒致病與免疫機(jī)制研究主要研究內(nèi)容：（1）EV71等病毒致病機(jī)制研究建立成年小鼠、恒河猴、轉(zhuǎn)基因小鼠等EV71感染動物模型；建立EV71病毒經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染模型和體外血腦屏障模型，利用基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)檢測比較單純經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)同正常小鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞表達(dá)譜差異，比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點蛋白；建立血腦屏障結(jié)構(gòu)細(xì)胞（腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞）和神經(jīng)軸突細(xì)胞、脊髓細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞的cDNA文庫及差異文庫，利用篩選與EV71蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞因子或靶分子；利用轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)對新發(fā)現(xiàn)的EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)作用因子進(jìn)行動物水平的系統(tǒng)研究，有針對性的比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異；闡明Toll樣受體對EV71病毒的識別機(jī)制及病毒編碼產(chǎn)物對干擾素激活抑制機(jī)制，探討天然免疫抑制與病毒致病機(jī)制的關(guān)系。（2）手足口病免疫保護(hù)機(jī)制的研究在縱向（不同病程）和橫向（不同病情程度、不同毒株感染）水平揭示病毒感染機(jī)體后免疫應(yīng)答的動態(tài)，闡明重要免疫細(xì)胞與病情發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的功能關(guān)聯(lián)性；探討不同劑量EV71感染中Th細(xì)胞亞型分化情況及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系；利用超速離心、電鏡、生物芯片以及實時細(xì)胞分析等技術(shù)探索EV71等病毒感染機(jī)體后免疫細(xì)胞間快速的信息交流和免疫抗原的傳遞等機(jī)制；利用動物模型揭示EV71滅活疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制，力爭開展I、II期臨床試驗。課題目標(biāo)：（1）揭示EV71侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制；（2）揭示EV71拮抗干擾素激活機(jī)制及其與EV71致病性的關(guān)系；（3）揭示交叉反應(yīng)的CD4T細(xì)胞對EV71免疫應(yīng)答和感染小鼠疾病進(jìn)程的影響，EV71感染導(dǎo)致特異的Th細(xì)胞亞型分化情況及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系；（4）闡明EV71滅活疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制和有效性評價指標(biāo)；（5）和建立完善用于EV71感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等保障條件；（6）培養(yǎng)中青年科研骨干10-15人，博士后、研究生20-25人；（7）在SCI收錄雜志上發(fā)表論文30篇以上。承擔(dān)單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點實驗室中國科學(xué)院上海巴斯德研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點實驗室課題負(fù)責(zé)人：王健偉，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：李琦涵，研究員，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所秦川，研究員，衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點實驗室冷啟彬，研究員，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所劉海鷹，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室劉映樂，副教授，病毒學(xué)國家重點實驗室雷曉波，助理研究員，病毒基因工程國家重點實驗室經(jīng)費比例：32.39%。課題4：腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究主要研究內(nèi)容：（1）腦膜炎奈瑟菌變異與流行規(guī)律研究研究我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律，研究不同血清群菌株之間莢膜合成基因簇的表達(dá)、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組的調(diào)控機(jī)制。研究我國主要流腦流行菌株的粘附定植能力和相關(guān)毒力基因、蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以期了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴(kuò)散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；研究我國流腦菌侵襲力及相關(guān)基因蛋白特征，以期了解細(xì)菌的粘附和侵襲毒力基因與白的相互關(guān)系；研究我國流腦菌株的變異規(guī)律。（3）腦膜炎奈瑟菌變異與致病機(jī)制關(guān)系研究選擇不同血清群、不同年代、不同基因型別的流腦菌代表菌株，進(jìn)行體外粘附試驗，比較不同流腦菌的粘附定植能力；分析我國流腦菌代表菌株流行變異規(guī)律和細(xì)菌在健康人群中定植傳播能力的關(guān)聯(lián)性；選擇與流腦菌粘附相關(guān)的因子編碼基因作為目的靶基因，進(jìn)行序列測定分析，同時采用逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和RNA測序等技術(shù)手段進(jìn)行粘附因子相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平檢測，研究粘附因子在不同流腦菌中的基因序列、轉(zhuǎn)錄水平、調(diào)控水平上的差異；進(jìn)行細(xì)菌-細(xì)胞相互作用實驗，研究不同流腦菌在侵襲力的差異性；通過序列測定檢測莢膜相關(guān)基因序列上的差異，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和RNA測序等技術(shù)手段檢測莢膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并進(jìn)一步探索莢膜基因序列和轉(zhuǎn)錄水平的差異與其侵襲能力的可能關(guān)系；以小RNA為切入點，選擇部分腦膜炎奈瑟菌毒力相關(guān)基因（包括粘附定植、侵襲和抗吞噬等相關(guān)基因），采用生物信息學(xué)預(yù)測、RNA測序、DNA微陣列、逆轉(zhuǎn)錄PCR、Northern雜交等技術(shù)開展調(diào)控機(jī)制探索性研究。收集和選擇一定數(shù)量的中國流腦菌臨床菌株，利用新一代測序技術(shù)進(jìn)行高通量序列分析，利用生物信息學(xué)技術(shù)手段尋找變異，并分析其規(guī)律。課題目標(biāo)：（1）掌握我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律；（2）了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴(kuò)散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；（3）了解細(xì)菌的粘附和侵襲毒力基因與蛋白的相互關(guān)系；（4）培養(yǎng)中青年研究骨干8-10人，博士后、研究生15-20名；（5）在SCI收錄雜志上發(fā)表論文20篇以上。承擔(dān)單位：中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室課題負(fù)責(zé)人：金奇，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：邵祝軍，研究員，傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室王千秋，研究員，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所張笑冰，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室彭俊平，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室經(jīng)費比例：17.05%。

四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1、誘導(dǎo)、分離和鑒定志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體；對志賀菌小RNA進(jìn)行預(yù)測和統(tǒng)計，并2、對預(yù)測的小RNA進(jìn)行初步驗證；分析福氏志賀氏菌1b和2b的全基因組序列，尋找并驗證負(fù)責(zé)O抗原側(cè)鏈修飾的噬菌體和關(guān)鍵基因;驅(qū)除不同亞群和不同血清型志賀氏菌菌株中的毒力大質(zhì)粒，獲得含有志賀氏菌毒力大質(zhì)粒的大腸桿菌，進(jìn)行志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達(dá)譜差異分析；3、比較不同EV71毒株的細(xì)胞和動物感染特性，構(gòu)建中國EV71主要流行株的感染性克隆，找出具有代表性突變序列，對EV71感染主要器官特別是神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞系進(jìn)行EV71細(xì)胞受體的表達(dá)譜分析，構(gòu)建EV71亞基因組復(fù)制子；4、構(gòu)建成年小鼠和恒河猴等EV71感染動物模型，建立EV71病毒經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染模型和體外血腦屏障模型，描述經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)譜變化，比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點蛋白；5、對我國不同年代、不同血清群流腦菌株進(jìn)行PFGE、MLST分子分型和種群結(jié)構(gòu)分析，篩選有代表性的菌株，建立細(xì)菌-宿主細(xì)胞粘附相互作用技術(shù)方法以及莢膜相關(guān)基因序列差異性檢測技術(shù)；進(jìn)行小RNA篩選；6、獲得研究所需菌毒種及樣本資源，進(jìn)行分析并建立信息數(shù)據(jù)庫。1、誘導(dǎo)、分離到至少3種血清型轉(zhuǎn)換噬菌體，建立福氏志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體庫；初步獲得志賀菌的小RNA庫，完成福氏志賀氏菌1b和2b的全基因組序列，證明O抗原側(cè)鏈修飾基因功能；初步完成志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達(dá)譜差異分析；2、完成對不同地區(qū)EV71分離株的序列分析測定，闡明其在細(xì)胞和動物上的感染特性，確立代表性突變序列,構(gòu)建我國EV71主要流行株（亞型）感染性克隆，獲得EV71細(xì)胞受體在多組織來源的細(xì)胞系中的表達(dá)譜。3、初步建立用于EV71感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等，初步揭示不同類型病人細(xì)胞因子等表達(dá)譜、免疫調(diào)制特征和機(jī)制；4、完成500株流腦菌株DNA的提取和PFGE、MLST分型分析,建立2-3種細(xì)菌宿主細(xì)胞粘附相互作用細(xì)胞模型,建立莢膜基因簇相關(guān)基因檢測和差異性分析技術(shù),完成代表株RNA測序；5、初步完成有關(guān)菌毒株的收集工作；6、發(fā)表SCI論文8-10篇。第二年1、對獲得的血清型相關(guān)噬菌體進(jìn)行基因組序列測定和鑒定，比較其與非優(yōu)勢血清型相關(guān)噬菌體的特征差異，尋找噬菌體基因組上優(yōu)勢決定基因或區(qū)域；對篩選出小RNA進(jìn)一步進(jìn)行鑒定分析，對多個毒力大質(zhì)粒編碼的小RNA進(jìn)行功能探討；篩選對志賀菌生長有明顯抑制作用的藥物；設(shè)計構(gòu)建志賀菌全基因組芯片；測定福氏志賀氏菌3a、4b的全基因組序列，尋找并驗證負(fù)責(zé)O抗原側(cè)鏈修飾的噬菌體和關(guān)鍵基因;解析不同福氏志賀氏菌血清型的分化機(jī)制和不同血清型之間轉(zhuǎn)化的變異機(jī)制；建立針對全部福氏志賀氏菌血清亞型的分子分型方法；分析志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達(dá)譜差異以及大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒前后在不同培養(yǎng)條件下的蛋白表達(dá)譜差異，篩選差異表達(dá)蛋白蛋；2、進(jìn)行EV71VP1的變異分析，分析不同重組突變病毒在細(xì)胞水平上的感染特性，開展不同EV71突變株3C、3C與宿主結(jié)合因子以及3C和抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，探討EV71（或結(jié)構(gòu)蛋白）與細(xì)胞受體相互作用的機(jī)制；3、建立完善EV71感染動物模型，篩選與EV71蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞性因子或靶分子，分析不同類型病人的細(xì)胞因子等表達(dá)差異以及對天然免疫的拮抗作用；4、完善細(xì)菌宿主粘附能力檢測技術(shù)和莢膜基因簇相關(guān)基因序列差異性檢測技術(shù)，對不同群代表性的菌株進(jìn)行粘附定植能力差異性、莢膜基因簇差異性和粘附相關(guān)基因進(jìn)行分析，建立粘附因子相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平檢測技術(shù)，繼續(xù)進(jìn)行小RNA分析。1、初步確定噬菌體基因組上優(yōu)勢決定基因或區(qū)域，初步了解志賀菌小RNA的生物學(xué)功能以及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制；完成福氏志賀氏菌3a和4b的全基因組序列，證明O抗原側(cè)鏈修飾基因功能；建立福氏志賀氏菌血清亞型的分子分型方法，初步解析不同福氏志賀氏菌血清型的分化機(jī)制和不同血清型之間轉(zhuǎn)化的變異機(jī)制；揭示志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后以及大腸桿菌獲得毒力大質(zhì)粒前后在不同培養(yǎng)條件下的蛋白表達(dá)譜差異;2、闡明EV71病毒的VP1編碼基因序列變異特征，以及重組EV71病毒在不同細(xì)胞上的感染特性，獲得3C蛋白晶體結(jié)構(gòu)或3C/抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，初步揭示EV71與受體相互作用的分子機(jī)制;3、完善用于EV71感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等，初步揭示不同病人細(xì)胞因子等表達(dá)特征和干擾素拮抗機(jī)制；4、闡明不同群流腦菌株對宿主細(xì)胞粘附力檢測，完成莢膜基因簇差異性分析和相關(guān)粘附基因的分析，對候選小RNA進(jìn)行鑒定；5、發(fā)表SCI論文10-15篇。第三年1、分析血清型轉(zhuǎn)換噬菌體感染及轉(zhuǎn)換志賀菌血清型別的可能性、特異性及感染時序以及其整合位點與多噬菌體DNA在宿主菌基因組上排列方式，描繪福氏志賀菌血清型間轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律；構(gòu)建3-5種抗菌藥物作用下志賀氏菌構(gòu)建轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)庫，完成志賀菌耐藥株和敏感株基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄組的差異分析，著重分析志賀菌獲得耐藥性的分子機(jī)理；選擇4株位于不同進(jìn)化位置的志賀氏菌進(jìn)行全基因組測序；分析菌株的蛋白復(fù)合物表達(dá)差異以及菌株間轉(zhuǎn)錄譜的差異；2、對來自不同年代，具有基因差異和地理分布特點的代表株進(jìn)行全基因組序列測定；分析不同重組突變EV71在動物體內(nèi)感染特性及其對宿主免疫系統(tǒng)影響與病理損害特征；進(jìn)行不同突變3D蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究；研究病毒非編碼區(qū)與病毒蛋白和宿主蛋白的相互作用及其對RNA復(fù)制的影響；3、對新發(fā)現(xiàn)的EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)作用因子進(jìn)行動物水平的系統(tǒng)研究，有針對性的比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異；揭示病毒感染機(jī)體后免疫應(yīng)答的動態(tài)，研究重要免疫細(xì)胞與病情發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的功能關(guān)聯(lián)性及EV71對天然免疫的拮抗機(jī)制。4、分析W135群、Y群、不可分群等其它血清群流腦菌株的粘附定植能力差異、莢膜基因簇差異和粘附定植相關(guān)基因，對代表性菌株進(jìn)行粘附因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測，選擇2個小RNA進(jìn)行功能分析。1、掌握噬菌體感染及轉(zhuǎn)換宿主志賀菌血清型別的特異性和時序性，完整描繪福氏痢疾桿菌血清型別轉(zhuǎn)換通路和規(guī)律，闡明噬菌體在宿主菌基因組上整合位點及排列方式；初步了解志賀氏菌的潛在耐藥機(jī)制，篩選出若干新的候選藥物靶標(biāo)；完成4株志賀菌的全基因組測序分析，闡明毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后志賀菌株蛋白復(fù)合物表達(dá)差異及轉(zhuǎn)錄譜差異；2、在全基因組水平闡明EV71代表株的遺傳變異特征；闡明不同重組病毒的體內(nèi)感染特性，包括宿主免疫和病理反應(yīng)；獲得3D或3CD與抑制劑復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及3CD與RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)；部分闡明EV71在神經(jīng)細(xì)胞復(fù)制中的參與的病毒及宿主蛋白；3、揭示EV71侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示EV71免疫調(diào)制和保護(hù)機(jī)制；4、闡明100株W135群、Y群、不可分群等流腦菌株宿主細(xì)胞粘附力差異，完成菌株粘附相關(guān)基因分析，構(gòu)建突變體進(jìn)行功能研究；5、發(fā)表SCI論文15-20篇。第四年1、分析噬菌體對志賀菌毒力基因表達(dá)的影響；分析和驗證志賀菌耐藥機(jī)制和調(diào)控機(jī)理；篩選志賀菌參與調(diào)控宿主免疫反應(yīng)的重要功能蛋白或毒力蛋白及其相互作用的蛋白和區(qū)域；選擇4株與不同志賀氏菌進(jìn)化簇關(guān)系較近的EIEC菌株進(jìn)行全基因組測序，分析不同志賀氏菌分化的主要動力和產(chǎn)生的結(jié)果，尋找在志賀氏菌形成過程中的關(guān)鍵基因上的SNP改變，分析志賀氏菌與EIEC菌株之間的進(jìn)化關(guān)系和差異，系統(tǒng)解析志賀氏菌的進(jìn)化起源機(jī)制；綜合分析并驗證上述比較蛋白質(zhì)組和比較轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，并分析相關(guān)基因的受調(diào)控水平；驗證差異表達(dá)復(fù)合物各組成亞基間的相互作用。2、探討我國EV71等病毒基因變異和神經(jīng)毒性的關(guān)系，闡明不同毒株在不同基因之間的進(jìn)化關(guān)系和病毒衍化來源，并對EV71病毒的重組進(jìn)行動態(tài)分析；進(jìn)行神經(jīng)毒性相關(guān)蛋白的篩選；進(jìn)行不同突變EV712A、2B、2C和3A蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究；分析EV71和脊髓灰質(zhì)炎來源IRES對翻譯效率的影響；鑒定參與病毒基因組翻譯的病毒蛋白、宿主蛋白；3、揭示Toll樣受體對EV71病毒的識別機(jī)制及病毒編碼產(chǎn)物對干擾素激活抑制機(jī)制，探討天然免疫抑制與病毒致病機(jī)制的關(guān)系，探討不同劑量EV71感染時Th細(xì)胞亞型分化情況及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系；4、對代表性的流腦菌株利用新一代測序技術(shù)進(jìn)行高通量序列分析，粘附定植能力不同的代表性流腦菌株進(jìn)行侵襲力的差異性以及莢膜基因簇遺傳變異規(guī)律分析；在以前研究基礎(chǔ)上，再選擇2-3個小RNA進(jìn)行功能分析。1、初步掌握不同噬菌體對志賀菌致病力和毒力的影響，了解福氏志賀菌優(yōu)勢血清型菌株的致病力特點；初步掌握志賀菌重點耐藥相關(guān)基因的調(diào)控功能；獲得志賀菌重要功能蛋白在宿主細(xì)胞中的靶蛋白并初步了解相應(yīng)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能；初步了解志賀菌進(jìn)化的動力、其形成過程中關(guān)鍵基因的變異、與EIEC菌株之間的進(jìn)化關(guān)系以及進(jìn)化起源機(jī)制；確定毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后志賀菌株差異蛋白相關(guān)基因的受調(diào)控水平以及差異表達(dá)復(fù)合物各組成亞基間的相互作用；2、揭示我國大陸流行的EV71病毒的型別特點、進(jìn)化特征及其與國外不同年代毒株的差別；初步確定EV71神經(jīng)毒性相關(guān)蛋白；獲得EV712A、2B、2C、3A及突變蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息，解析1-2個晶體結(jié)構(gòu)；鑒定出若干神經(jīng)細(xì)胞中參與EV71翻譯的病毒、宿主蛋白；3、深入揭示EV71拮抗干擾素激活機(jī)制及其與EV71致病性的關(guān)系、交叉反應(yīng)的CD4T細(xì)胞對EV71免疫應(yīng)答和感染小鼠疾病進(jìn)程的影響以及EV71感染導(dǎo)致特異的Th細(xì)胞亞型分化情況及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系；4、完成10-20株代表性流腦菌株高通量測序分析、粘附能力差異性代表性菌株侵襲力的差異性及調(diào)控機(jī)制分析并構(gòu)建突變體進(jìn)行功能研究；5、發(fā)表SCI論文20-30篇。第五年1、分析不同血清型福氏志賀菌抗酸性、耐藥性等及環(huán)境適應(yīng)性差異，探討環(huán)境中噬菌體與血清型流行強(qiáng)度及血清型變遷的關(guān)系；研究宿主相應(yīng)上下游信號通路的傳遞情況，并借助動物模型進(jìn)行進(jìn)一步評價；對志賀氏菌的基因組組成、多態(tài)性特征和變異機(jī)制進(jìn)行深入分析，認(rèn)識志賀氏菌進(jìn)化和變異的規(guī)律和趨勢；捕獲轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控蛋白；篩選調(diào)節(jié)染色體基因表達(dá)的毒力大質(zhì)?；颍瑯?gòu)建突變體利用細(xì)胞和動物模型評價與毒力的關(guān)系，提出毒力大質(zhì)粒對染色體的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)染色體編碼的新的抗毒力因子；2、開展我國手足口病病原譜研究；構(gòu)建無神經(jīng)毒或低神經(jīng)毒的重組EV71；進(jìn)行EV71病毒顆粒或病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究；探討病毒非編碼區(qū)及病毒蛋白、宿主蛋白的相互作用對病毒基因組翻譯的影響；3、探索EV71等病毒感染機(jī)體后免疫細(xì)胞間快速的信息交流和免疫抗原的傳遞等機(jī)制；根據(jù)動物模型和臨床試驗數(shù)據(jù)，揭示EV71滅活疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制；4、進(jìn)行數(shù)據(jù)深入分析和課題總結(jié)。1、初步了解噬菌體對福氏志賀菌環(huán)境適應(yīng)性的影響，了解福氏志賀氏菌優(yōu)勢血清型菌株的耐藥和環(huán)境適應(yīng)能力特點，初步揭示血清轉(zhuǎn)換噬菌體與福氏志賀菌血清變遷的關(guān)系；初步闡明志賀菌重要功能蛋白參與調(diào)控宿主相關(guān)免疫信號途徑的作用方式；初步認(rèn)識志賀氏菌進(jìn)化和變異的規(guī)律和趨勢；提出毒力大質(zhì)粒對染色體的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)染色體編碼的新的抗毒力因子；完成相關(guān)基因缺失突變體和過表達(dá)突變體毒力評價；鑒別出轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控蛋白；2、揭示我國手足口病病原譜特征，初步闡明EV71病毒的基因和重要蛋白表位的變異特征以及病毒進(jìn)化和EV71毒力（致病力）的關(guān)系，篩選出低毒或無毒的重組EV71，初步獲得病毒顆粒晶體結(jié)構(gòu)或病毒顆粒冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，初步闡明EV71病毒復(fù)制及翻譯機(jī)理；3、進(jìn)一步闡明EV71對宿主免疫的調(diào)控機(jī)制，闡明EV71滅活疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制和有效性評價指標(biāo)；4、闡明我國代表菌株流行變異規(guī)律和細(xì)菌在健康人群中定植傳播能力的關(guān)聯(lián)性；5、發(fā)表SCI論文20-30篇。

一、研究內(nèi)容研究表明，自然資源開發(fā)、環(huán)境變化、人口老化、人員流動、抗生素濫用、人群免疫水平改變等多方面的原因均可導(dǎo)致病原體的變異。病原體通過變異不斷適應(yīng)宿主，但是其變異往往也導(dǎo)致致病力、耐藥性、流行特性和臨床表現(xiàn)等發(fā)生改變，從而給臨床診斷、治療、疫苗研發(fā)和預(yù)防控制帶來困難，因此如何應(yīng)對病原體變異是傳染病防控面臨的長期巨大挑戰(zhàn)；病原體通過非常復(fù)雜的機(jī)制導(dǎo)致疾病，但是迄今對病原體致病機(jī)制的認(rèn)識總體上尚十分膚淺，揭示其致病機(jī)制仍是戰(zhàn)勝傳染病的一項長期任務(wù)。因此，闡明病原體流行變異規(guī)律并在此基礎(chǔ)上揭示其與致病機(jī)制的關(guān)系，對于研發(fā)有效的疫苗和治療藥物以及制定、完善有效的治療方案和防控措施均具有重要意義。鑒此，本項目擬以病原體變異規(guī)律與致病機(jī)制這兩個傳染病基礎(chǔ)研究中的核心科學(xué)問題為突破口，針對我國現(xiàn)階段居于傳染病發(fā)病率前列的痢疾、手足口病以及流行型別和模式發(fā)生轉(zhuǎn)變、對社會造成嚴(yán)重沖擊的流腦等重要傳染病病原體的流行變異規(guī)律和致病機(jī)制開展相關(guān)研究，從而為其有效防控打下基礎(chǔ)。本項目圍繞上述科學(xué)問題，根據(jù)不同病原體的特征，擬分成志賀氏菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究、EV71等病毒變異與毒力關(guān)系的研究、EV71等病毒致病與免疫機(jī)制研究、腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究等四部分內(nèi)容：（一）志賀氏菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是福氏志賀氏菌通過血清型變遷實現(xiàn)流行和致病的分子機(jī)制。變異是志賀氏菌流行病學(xué)的一個最顯著的特點，它既是志賀氏菌逃避免疫屏障，保持流行強(qiáng)度的重要機(jī)制之一，也對進(jìn)一步發(fā)展和使用志賀氏菌疫苗具有決定性意義。圍繞該科學(xué)問題擬主要開展以下研究：福氏志賀氏菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體解析和變異機(jī)制的研究通過不同的誘導(dǎo)方法，建立福氏志賀氏菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體庫。利用它在實驗室構(gòu)建自然界分離到的血清型菌株，研究血清型轉(zhuǎn)化機(jī)制、噬菌體單獨或共轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點、噬菌體和流行強(qiáng)度的關(guān)系、噬菌體對宿主菌致病力的影響等。優(yōu)勢血清型福氏志賀氏菌重要蛋白復(fù)合物和毒力蛋白功能針對Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力蛋白在痢疾桿菌感染中能下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的現(xiàn)象，尋找其在宿主細(xì)胞中的作用靶點；研究相關(guān)毒力蛋白和其它重要功能蛋白參與調(diào)控宿主相關(guān)免疫信號途徑的新作用方式等。優(yōu)勢血清型福氏志賀氏菌耐藥特點研究從志賀菌全基因組和轉(zhuǎn)錄組水平高通量、全方位篩選耐藥相關(guān)基因，系統(tǒng)評價志賀菌單耐藥和多重耐藥產(chǎn)生過程中獲得耐藥性的主要變異方式及分子機(jī)理，從而為臨床耐藥監(jiān)測和開發(fā)針對耐藥菌的新型抗菌藥物提供潛在的分子靶位。優(yōu)勢血清型志賀氏菌毒力大質(zhì)粒和染色體的協(xié)同進(jìn)化研究通過比較多種優(yōu)勢血清型志賀氏菌菌株去除毒力大質(zhì)粒前后、非致病性大腸桿菌導(dǎo)入毒力大質(zhì)粒前后的蛋白表達(dá)譜和復(fù)合物譜的變化，并對這種變化背后的原因進(jìn)行分析與研究，對志賀氏菌毒力大質(zhì)粒和染色體協(xié)同進(jìn)化進(jìn)行較為全面系統(tǒng)的研究，以期獲得致病菌適應(yīng)性進(jìn)化的新證據(jù)和新途徑。（二）EV71等病毒變異與毒力關(guān)系的研究擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是EV71等病毒遺傳變異規(guī)律及其與毒力關(guān)系。和其他腸道病毒類似，EV71具有較高的變異頻率，但我國EV71的變異規(guī)律和趨勢尚不清楚，且對其變異與毒力的關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究將為我國EV71的監(jiān)測與疫苗株的篩選提供依據(jù)，并為闡明其致病機(jī)制提供線索。圍繞該科學(xué)問題擬重點開展以下研究：我國不同地區(qū)EV71流行變異規(guī)律研究通過對不同地區(qū)、不同時間分離毒株的大規(guī)模序列分析，闡明中國大陸流行的EV71病毒的基因變異規(guī)律及病毒基因型別進(jìn)化，揭示不同毒株的進(jìn)化關(guān)系和病毒衍化來源，宏觀了解我國病毒基因變異和致病性的關(guān)系，為手足口病監(jiān)測、防控策略的制定和疫苗株篩選等提供依據(jù)。EV71變異與病毒毒力關(guān)系的研究構(gòu)建無神經(jīng)毒或低神經(jīng)毒的重組EV71，尋找潛在的毒力位點；篩選與重要致病蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞因子或靶分子，鑒別阻斷病毒有效復(fù)制或產(chǎn)生致病性的關(guān)鍵靶點；解析EV71變異體病毒顆粒和重要功能蛋白的三維結(jié)構(gòu)，為揭示病毒變異導(dǎo)致功能和毒力變異機(jī)制提供基礎(chǔ)、為有效疫苗及治療型藥物的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。（三）EV71等病毒致病與免疫機(jī)制研究擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是EV71等病毒的致病與免疫保護(hù)機(jī)制。目前EV71的致病和免疫機(jī)制尚不清楚，且缺乏靈敏、簡易的動物模型，從而使其臨床治療方案的制訂、疫苗和藥物研發(fā)等缺乏科學(xué)依據(jù)。圍繞該科學(xué)問題擬重點開展以下研究：EV71等致病機(jī)制研究研制靈敏、簡易的動物模型；揭示EV71的神經(jīng)嗜性機(jī)制，篩選和鑒定參與不同EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)路線的相關(guān)作用因子；闡明EV71拮抗宿主天然免疫的機(jī)制及其與致病性的關(guān)系等，為發(fā)現(xiàn)抗病毒靶點、制訂臨床救治方案及研發(fā)安全有效疫苗等提供基礎(chǔ)。EV71免疫保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)行病毒感染機(jī)體后免疫應(yīng)答的動態(tài)學(xué)研究，了解重要免疫細(xì)胞及其免疫因子與病情發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的功能關(guān)聯(lián)性，揭示細(xì)胞免疫等獲得性免疫與疾病的關(guān)系；利用滅活疫苗等闡明機(jī)體保護(hù)性免疫的機(jī)制等，為早期識別重癥病例、減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷和開展科學(xué)治療，以及評估EV71疫苗的安全性和有效性提供依據(jù)。（四）腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機(jī)制研究擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是腦膜炎奈瑟菌變異和致病性的關(guān)系。通過該研究闡明腦膜炎奈瑟菌在人群中的定植、傳播和變異的規(guī)律，掌握流腦菌粘附侵襲相關(guān)的調(diào)控機(jī)制和研制疫苗等提供依據(jù)。擬重點開展以下研究：1.腦膜炎奈瑟菌流行變異規(guī)律及其在健康人群中定植傳播能力的關(guān)聯(lián)性研究選擇代表性腦膜炎奈瑟菌菌株，利用新一代測序技術(shù)進(jìn)行高通量序列分析，尋找變異，并分析其規(guī)律；比較不同腦膜炎奈瑟菌的粘附定植能力。分析我國腦膜炎奈瑟菌代表菌株流行變異規(guī)律和細(xì)菌在健康人群中定植傳播能力的關(guān)聯(lián)性。2.腦膜炎奈瑟菌粘附與侵襲能力差異研究選擇與腦膜炎奈瑟菌粘附相關(guān)的因子編碼基因作為目的靶基因,研究粘附因子在不同膜炎奈瑟菌中的基因序列、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控水平上的差異；進(jìn)行細(xì)菌-細(xì)胞相互作用實驗，研究不同流腦菌在侵襲力的差異性；同時檢測莢膜相關(guān)基因序列上的差異，并進(jìn)一步探索莢膜基因序列和轉(zhuǎn)錄水平的差異與其侵襲能力的可能關(guān)系。3.腦膜炎奈瑟菌調(diào)控機(jī)制研究以小RNA為切入點，選擇部分腦膜炎奈瑟菌毒力相關(guān)基因開展調(diào)控機(jī)制的探索性研究。

畢業(yè)設(shè)計（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說明原創(chuàng)性聲明本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設(shè)計（論文），是我個人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已經(jīng)發(fā)表或公布過的研究成果，也不包含我為獲得及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過的材料。對本研究提供過幫助和做出過貢獻(xiàn)的個人或集體，均已在文中作了明確的說明并表示了謝意。作者簽名：日期：指導(dǎo)教師簽名：日期：使用授權(quán)說明本人完全了解大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計（論文）的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)校可以采用影印、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉績?nèi)容。作者簽名：日期：

學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名： 日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。涉密論文按學(xué)校規(guī)定處理。作者簽名： 日期：年月日導(dǎo)師簽名：日期：年月日

致謝時間飛逝，大學(xué)的學(xué)習(xí)生活很快就要過去，在這四年的學(xué)習(xí)生活中，收獲了很多，而這些成績的取得是和一直關(guān)心幫助我的人分不開的。首先非常感謝學(xué)校開設(shè)這個課題，為本人日后從事計算機(jī)方面的工作提供了經(jīng)驗，奠定了基礎(chǔ)。本次畢業(yè)設(shè)計大概持續(xù)了半年，現(xiàn)在終于到結(jié)尾了。本次畢業(yè)設(shè)計是對我大學(xué)四年學(xué)習(xí)下來最好的檢驗。經(jīng)過這次畢業(yè)設(shè)計，我的能力有了很大的提高，比如操作能力、分析問題的能力、合作精神、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)等方方面面都有很大的進(jìn)步。這期間凝聚了很多人的心血，在此我表示由衷的感謝。沒有他們的幫助，我將無法順利完成這次設(shè)計。首先，我要特別感謝我的知道郭謙功老師對我的悉心指導(dǎo)，在我的論文書寫及設(shè)計過程中給了我大量的幫助和指導(dǎo)，為我理清了設(shè)計思路和操作方法，并對我所做的課題提出了有效的改進(jìn)方案。郭謙功老師淵博的知識、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)和誨人不倦的態(tài)度給我留下了深刻的印象。從他身上，我學(xué)到了許多能受益終生的東西。再次對周巍老師表示衷心的感謝。其次，我要感謝大學(xué)四年中所有的任課老師和輔導(dǎo)員在學(xué)習(xí)期間對我的嚴(yán)格要求，感謝他們對我學(xué)習(xí)上和生活上的幫助，使我了解了許多專業(yè)知識和為人的道理，能夠在今后的生活道路上有繼續(xù)奮斗的力量。另外，我還要感謝大學(xué)四年和我一起走過的同學(xué)朋友對我的關(guān)心與支持，與他們一起學(xué)習(xí)、生活，讓我在大學(xué)期間生活的很充實，給我留下了很多難忘的回憶。最后，我要感謝我的父母對我的關(guān)系和理解，如果沒有他們在我的學(xué)習(xí)生涯中的無私奉獻(xiàn)和默默支持，我將無法順利完成今天的學(xué)業(yè)。致謝四年的大學(xué)生活就快走入尾聲，我們的校園生活就要劃上句號，心中是無盡的難舍與眷戀。從這里走出，對我的人生來說，將是踏上一個新的征程，要把所學(xué)的知識應(yīng)用到實際工作中去。回首四年，取得了些許成績，生活中有快樂也有艱辛。感謝老師四年來對我孜孜不倦的教誨，對我成長的關(guān)心和愛護(hù)。學(xué)友情深，情同兄妹。四年的風(fēng)風(fēng)雨雨，我們一同走過，充滿著關(guān)愛，給我留下了值得珍藏的最美好的記憶。在我的十幾年求學(xué)歷程里，離不開父母的鼓勵和支持，是他們辛勤的勞作，無私的付出，為我創(chuàng)造良好的學(xué)習(xí)條件，我才能順利完成完成學(xué)業(yè)，感激他們一直以來對我的撫養(yǎng)與培育。最后，我要特別感謝我的導(dǎo)師劉望蜀老師、和研究生助教吳子儀老師。是他們在我畢業(yè)的最后關(guān)頭給了我們巨大的幫助與鼓勵，給了我很多解決問題的思路，在此表示衷心的感激。老師們認(rèn)真負(fù)責(zé)的工作態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神和深厚的理論水平都使我收益匪淺。他無論在理論上還是在實踐中，都給與我很大的幫助，使我得到不少的提高這對于我以后的工作和學(xué)習(xí)都有一種巨大的幫助，感謝他耐心的輔導(dǎo)。在論文的撰寫過程中老師們給予我很大的幫助，幫助解決了不少的難點，使得論文能夠及時完成，這里一并表示真誠的感謝?；贑8051F單片機(jī)直流電動機(jī)反饋控制系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機(jī)的嵌入式Web服務(wù)器的研究MOTOROLA單片機(jī)MC68HC（8）05PV8/A內(nèi)嵌EEPROM的工藝和制程方法及對良率的影響研究基于模糊控制的電阻釬焊單片機(jī)溫度控制系統(tǒng)的研制基于MCS-51系列單片機(jī)的通用控制模塊的研究基于單片機(jī)實現(xiàn)的供暖系統(tǒng)最佳啟停自校正（STR）調(diào)節(jié)器單片機(jī)控制的二級倒立擺系統(tǒng)的研究基于增強(qiáng)型51系列單片機(jī)的TCP/IP協(xié)議棧的實現(xiàn)基于單片機(jī)的蓄電池自動監(jiān)測系統(tǒng)基于32位嵌入式單片機(jī)系統(tǒng)的圖像采集與處理技術(shù)的研究基于單片機(jī)的作物營養(yǎng)診斷專家系統(tǒng)的研究基于單片機(jī)的交流伺服電機(jī)運動控制系統(tǒng)研究與開發(fā)基于單片機(jī)的泵管內(nèi)壁硬度測試儀的研制基于單片機(jī)的自動找平控制系統(tǒng)研究基于C8051F040單片機(jī)的嵌入式系統(tǒng)開發(fā)基于單片機(jī)的液壓動力系統(tǒng)狀態(tài)監(jiān)測儀開發(fā)模糊Smith智能控制方法的研究及其單片機(jī)實現(xiàn)一種基于單片機(jī)的軸快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于雙單片機(jī)沖床數(shù)控系統(tǒng)的研究基于CYGNAL單片機(jī)的在線間歇式濁度儀的研制基于單片機(jī)的噴油泵試驗臺控制器的研制基于單片機(jī)的軟起動器的研究和設(shè)計基于單片機(jī)控制的高速快走絲電火花線切割機(jī)床短循環(huán)走絲方式研究基于單片機(jī)的機(jī)電產(chǎn)品控制系統(tǒng)開發(fā)基于PIC單片機(jī)的智能手機(jī)充電器基于單片機(jī)的實時內(nèi)核設(shè)計及其應(yīng)用研究基于單片機(jī)的遠(yuǎn)程抄表系統(tǒng)的設(shè)計與研究基于單片機(jī)的煙氣二氧化硫濃度檢測儀的研制基于微型光譜儀的單片機(jī)系統(tǒng)單片機(jī)系統(tǒng)軟件構(gòu)件開發(fā)的技術(shù)研究基于單片機(jī)的液體點滴速度自動檢測儀的研制基于單片機(jī)系統(tǒng)的多功能溫度測量儀的研制基于PIC單片機(jī)的電能采集終端的設(shè)計和應(yīng)用基于單片機(jī)的光纖光柵解調(diào)儀的研制氣壓式線性摩擦焊機(jī)單片機(jī)控制系統(tǒng)的研制基于單片機(jī)的數(shù)字磁通門傳感器基于單片機(jī)的旋轉(zhuǎn)變壓器-數(shù)字轉(zhuǎn)換器的研究基于單片機(jī)的光纖Bragg光柵解調(diào)系統(tǒng)的研究單片機(jī)控制的便攜式多功能乳腺治療儀的研制基于C8051F020單片機(jī)的多生理信號檢測儀基于單片機(jī)的電機(jī)運動控制系統(tǒng)設(shè)計Pico專用單片機(jī)核的可測性設(shè)計研究基于MCS-51單片機(jī)的熱量計基于雙單片機(jī)的智能遙測微型氣象站MCS-51單片機(jī)構(gòu)建機(jī)器人的實踐研究基于單片機(jī)的輪軌力檢測基于單片機(jī)的GPS定位儀的研究與實現(xiàn)基于單片機(jī)的電液伺服控制系統(tǒng)用于單片機(jī)系統(tǒng)的MMC卡文件系統(tǒng)研制基于單片機(jī)的時控和計數(shù)系統(tǒng)性能優(yōu)化的研究基于單片機(jī)和CPLD的粗光柵位移測量系統(tǒng)研究單片機(jī)控制的后備式方波UPS提升高職學(xué)生單片機(jī)應(yīng)用能力的探究基于單片機(jī)控制的自動低頻減載裝置研究基于單片機(jī)控制的水下焊接電源的研究基于單片機(jī)的多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于uPSD3234單片機(jī)的氚表面污染測量儀的研制基于單片機(jī)的紅外測油儀的研究96系列單片機(jī)仿真器研究與設(shè)計基于單片機(jī)的單晶金剛石刀具刃磨設(shè)備的數(shù)控改造基于單片機(jī)的溫度智能控制系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)基于MSP430單片機(jī)的電梯門機(jī)控制器的研制基于單片機(jī)的氣體測漏儀的研究基于三菱M16C/6N系列單片機(jī)的CAN/USB協(xié)議轉(zhuǎn)換器基于單片機(jī)和DSP的變壓器油色譜在線監(jiān)測技術(shù)研究基于單片機(jī)的膛壁溫度報警系統(tǒng)設(shè)計基于AVR單片機(jī)的低壓無功補(bǔ)償控制器的設(shè)計基于單片機(jī)船舶電力推進(jìn)電機(jī)監(jiān)測系統(tǒng)基于單片機(jī)網(wǎng)絡(luò)的振動信號的采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的大容量數(shù)據(jù)存儲技術(shù)的應(yīng)用研究基于單片機(jī)的疊圖機(jī)研究與教學(xué)方法實踐基于單片機(jī)嵌入式Web服務(wù)器技術(shù)的研究及實現(xiàn)基于AT89S52單片機(jī)的通用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)基于單片機(jī)的多道脈沖幅度分析儀研究HYPERLINK"/detail.h