谷胱甘肽響應(yīng)的可激活磁共振成像納米探針的制備研究

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1緒論1.1研究背景近年來，腫瘤的發(fā)生越來越多，且發(fā)病年齡越來越年輕化。然而，腫瘤很難在早期得到及時診斷和治療，因此，惡性腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見病，多發(fā)病，早期特異性診斷可提高患者生存率，改善生活質(zhì)量[1]。由于傳統(tǒng)影像診斷方法主要針對實(shí)質(zhì)性腫瘤，此時患者已經(jīng)處于臨床中晚期，故治療效果差，預(yù)后較差。所以，惡性腫瘤仍然是威脅人類健康與壽命的一大關(guān)鍵因素。因此，在臨床上找到一種有效的腫瘤檢查方式與診斷方法并進(jìn)行良惡性判定具有十分重要的意義。既往有大量的研究專注于尋找特異性的腫瘤血清標(biāo)志物，應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中谷胱甘肽（GSH）含量明顯高于腫瘤旁組織，在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，谷胱甘肽的濃度為（6.29士0.67）nmol/106。吳琛珩等對人消化道腫瘤組織的檢測結(jié)果也揭示，腫瘤組織內(nèi)還原性谷胱甘肽和輔酶Ⅰ（GSH、NADPH）的含量顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，提示腫瘤細(xì)胞中確有GSH的高表達(dá)[3]。隨著分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)影像學(xué)的飛速發(fā)展，近年來產(chǎn)生了一門新興的交叉學(xué)科--分子影像學(xué)。分子影像學(xué)是指運(yùn)用影像學(xué)的手段，在組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平顯示活體狀態(tài)下某些特定分子的變化，對生物學(xué)行為進(jìn)行定性和定量的研究，為疾病過程在體監(jiān)測、基因治療、在體示蹤、藥物在體療效評測和功能分子在體活動規(guī)律研究提供新技術(shù)。分子影像學(xué)在疾病早期診斷、提供疾病發(fā)展重要信息和評價治療效果方面具有誘人的潛能，具有無創(chuàng)、實(shí)時、在體、特異、精細(xì)顯像等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。所以，分子影像技術(shù)可望為疾病的研究和臨床“早早期”診斷、治療提供基因分子水平信息，而在分子影像學(xué)成像技術(shù)中，靶向性和高親和性分子探針的制備起著關(guān)鍵作用[7-8]。磁共振成像是利用生物體不同組織在磁共振過程中產(chǎn)生的具有不同特征的電磁波信號成像技術(shù)，是上世紀(jì)80年代以來醫(yī)學(xué)影像學(xué)發(fā)展的最新成就之—[9-10]。磁共振成像技術(shù)也因?yàn)槠錈o創(chuàng)傷性、無輻射損傷、非侵入性、并具有多序列、多參數(shù)（不同組織與磁共振有關(guān)的特征參數(shù)如質(zhì)子密度、縱向弛豫時間、橫向弛豫時間、彌散系數(shù)等都可以作為成像參數(shù)）、任意平面成像、較高的密度分辨率等優(yōu)點(diǎn)[11]廣泛的應(yīng)用于臨床，已經(jīng)成為臨床診斷中最常用的影像檢查手段之一[12]。但是隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速的發(fā)展和人們生活水平的日益提高，常規(guī)的磁共振檢查已經(jīng)不能滿足臨床診斷的要求，人們對磁共振成像的特異性、精確性、敏感性提出了更高的要求。為了實(shí)現(xiàn)對微小病變及隱匿病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，學(xué)者紛紛投入到提高疾病診斷準(zhǔn)確性的成像方法的研究。雖然單一的磁共振成像設(shè)備已經(jīng)對脂肪、軟組織等低密度組織具有的成像效果，但它仍然不可以實(shí)現(xiàn)對全身任意組織的掃描成像并提供有診斷價值的圖像。通過磁共振和其他成像設(shè)備的結(jié)合（例如磁共振和PET的結(jié)合形成PETMRI）[13-14]，多通道探測器可視化的開發(fā)，不僅可以從解剖水平觀察病變，而且可以從分子代謝水平研究病變組織的代謝情況從而定性診斷疾病。但是這樣的組合仍然存在許多固有的問題，如因多個成像器件空間分辨率及時間分辨率的圖像定位導(dǎo)致生物樣品的差異所造成的困難[15]。另一解決方案為：磁共振對比劑。磁共振對比劑的應(yīng)用更是極大地拓展了磁共振成像技術(shù)的臨床適用范圍。磁共振造影劑是能夠縮短組織在外磁場作用下的共振時間、增大對比信號的差異、提高成像對比度和清晰度的一類診斷試劑[16]。磁共振對比增強(qiáng)的基本原理是通過改變內(nèi)、外界弛豫效應(yīng)和磁化率效應(yīng)間接地改變組織的信號強(qiáng)度，從而達(dá)到提高不同組織間信號差異的目的。磁共振對比劑的應(yīng)用，可以增強(qiáng)正常組織與病變組織之間的信號對比，使微小病變更加突出，使得微小病變與隱匿病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷成為可能。它能有效改變生物體內(nèi)組織中局部的水質(zhì)子弛豫速率，縮短水分子中質(zhì)子的弛豫時間，準(zhǔn)確地檢測出正常組織與患病部位之間的差異，從而最終顯示生物體內(nèi)各器官或組織的功能狀態(tài)。磁共振對比劑要應(yīng)用于人體，除了要滿足藥物的基本要求，具有生物適應(yīng)性、水溶性好和良好的穩(wěn)定性外，還應(yīng)具有以下特性：（1）靶向性：即對比劑進(jìn)入人體后能選擇性聚集，在靶組織富集并停留一段時間，使靶區(qū)域被觀測核的弛豫速率比其他正常組織部位有更大的增強(qiáng)，以達(dá)到增加正常組織與病變組織的對比度。（2）細(xì)胞毒性?。簩Ρ葎┲杏坞x的稀土金屬離子和配體毒性較強(qiáng)，而其配合物毒性較低。稀土金屬離子的置換效應(yīng)是毒副作用的主要影響因素，所以MRI對比劑在體內(nèi)的有效期中應(yīng)為穩(wěn)定配合物。（3）高的弛豫率：對比劑對水質(zhì)子的弛豫能力影響其在體內(nèi)磁共振成像的效果。弛豫能力越強(qiáng)，活體成像效果就越好。（4）在體內(nèi)有適當(dāng)?shù)拇媪魰r間：既為成像提供必要的時間，又易于從體內(nèi)排出，不會在體內(nèi)積累。按增強(qiáng)類型不同，磁共振對比劑可以分為陽性對比劑和陰性對比劑。陽性對比劑一般是指可以增強(qiáng)信號強(qiáng)度的順磁性物質(zhì)，例如軋劑、氧化錳等。陽性對比劑以縮短T1弛豫時間為主（在T1加權(quán)成像中增加信號的強(qiáng)度），表現(xiàn)在圖像上增強(qiáng)區(qū)顯示信號增強(qiáng)。在T1加權(quán)像中，由公式I=KN(H)(1-e-TR/T1)可知，如果組織器官的T1短，則MR信號強(qiáng)度強(qiáng)，圖像變亮；如果組織器官T1長，則MR信號強(qiáng)度弱，圖像變暗。目前應(yīng)用最廣泛的磁共振陽性對比劑即Gd-DTPA，中文名為二乙三胺五醋酸釓或釓噴酸葡甲胺鹽，商品名為馬根維顯（Magnevist）[17-18]。Gd-DTPA是一種順磁性物質(zhì)，它的增強(qiáng)原理為：Gd3+具有7個不成對電子，其不成對電子與質(zhì)子一樣為偶極子，具有磁距。電子質(zhì)量很輕，但其磁距約為質(zhì)子的657倍。在無順磁性物質(zhì)的情況下，組織的T1弛豫是由質(zhì)子之間的偶極子-偶極子相互作用，形成局部磁場波動所引起的。在有不成對電子的順磁性物質(zhì)存在時，由于電子的磁化率約為質(zhì)子的657倍，從而產(chǎn)生局部巨大磁場波動。此時，大部分電子的運(yùn)動頻率與Larmor頻率相近，而使鄰近質(zhì)子的T1弛豫時間縮短，即形成所謂質(zhì)子偶極子-電子偶極子之間的偶極子-偶極子相互作用，引起所謂質(zhì)子磁豫增強(qiáng)，其結(jié)果造成T1弛豫時間縮短。在Gd-DTPA濃度較低時，由于機(jī)體組織的T1弛豫時間較長，故對比劑對機(jī)體組織的T1弛豫時間影響較大。然而，隨著Gd-DTPA濃度增加，T2縮短效應(yīng)漸趨明顯。Gd-DTPA通過改變周圍氫核的磁性起作用，具有親水性、相對分子質(zhì)量小的特點(diǎn)，注入血管后迅速向周圍組織間隙分布，由腎臟排泄，對各系統(tǒng)的病變都有診斷與鑒別診斷的價值。雖然Gd-DTPA被廣泛的應(yīng)用于臨床[19-22]，但存在很多的缺陷。為了降低Gd3+本身的毒性，人們采取制備釓離子螯合物的方式來提高對比劑的生物相容性。但螯合物的形成會降低對比劑的對比度，因?yàn)榕c水合釓離子的8-9個位點(diǎn)來說，釓離子螯合物中可與水質(zhì)子交換的配位點(diǎn)的數(shù)目只有1-2個。另一方面，絕大多數(shù)的釓對比劑的血液循環(huán)時間較短，對組織和細(xì)胞缺少選擇性，難于表面功能化也限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。同時，釓離子螯合物中的Gd3+一旦去螯合或者與人體中存在的其他離子，如Zn2+等，交換螯合后被釋放有可能會帶來潛在的毒性。而且有報道指出釓基對比劑會對生物體腎小管造成直接損害，引起腎細(xì)胞纖維化[23]。且絕大多數(shù)釓類小分子對比劑都是離子型造影劑，體內(nèi)滲透壓較高，在體內(nèi)存留時間較短，易經(jīng)腎臟代謝后迅速排出，不具有組織或器官的選擇性，常常迅速滲透到細(xì)胞外液間隙而產(chǎn)生背景影像強(qiáng)化。因此，如何開發(fā)具有靶向性、高弛豫效率、使用安全的對比劑是MRI研究的重點(diǎn)和主要發(fā)展方向之一。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，關(guān)于納米粒子的研究越來越成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，許多納米材料的磁共振陽性對比劑應(yīng)運(yùn)而生[24]，例如：PEG-Gd2O3、BSA-Gd2O3[25-26]等。由于納米粒子的特性，更易于進(jìn)行表面功能化與功能組裝，提高其靶向性。使對比劑不僅具可以輔助診斷，而且可以具有治療作用。陰性對比劑通常是超順磁性的納米粒子（例如氧化鐵）及高濃度的順磁性物質(zhì)。陰性對比劑以縮短T2弛豫時間為主（在T2加權(quán)成像中降低信號強(qiáng)度），呈暗或黑色低信號。在T2加權(quán)像中，由公式I=KN(H)e-TE/T2可知，如果組織器官T2長，則MR信號強(qiáng)度強(qiáng)，圖像變亮；如果組織器官T2短，則MR信號強(qiáng)度弱，圖像變暗。超順磁性氧化鐵（SPIO：SuperparamagneticIronOxide）是近年來迅速發(fā)展的一種納米材料[27]，由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在較弱的外磁場中就可產(chǎn)生巨大的磁性，而外磁場撤銷后無剩磁。它的作用原理為：SPIO顆粒直徑40~400m，表面用葡聚糖包裹。由于血液中直徑在30~5000nm的顆粒主要經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，因而靜脈注射后該類對比劑進(jìn)入肝臟及脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞(RES：Reticuloendothelialsystem)，產(chǎn)生短T2效應(yīng)，在肝臟枯否細(xì)胞可攝取對比劑顆粒。由于正常肝臟存在枯否細(xì)胞，而腫瘤內(nèi)一般無或少含無枯否細(xì)胞，因此對比劑能增加腫瘤與肝實(shí)質(zhì)間的對比，從而提高肝臟腫瘤的檢出率，對鑒別腫瘤是否肝細(xì)胞來源也有較大價值。目前有多種網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞性MR對比劑已經(jīng)商品化，如AMI-25和Feridex（菲立磁）[28]等。SPIO納米粒子由不同的外層材料包裹三氧化二鐵或四氧化三鐵形成，其顆粒小，穿透力強(qiáng)，弛豫率為同條件下釓離子的7-10倍，在很低濃度條件下即可在MRI形成對比[29]。更重要的是，SPIO納米粒子通過表面化學(xué)修飾可以進(jìn)一步結(jié)合特殊的抗體、氨基酸、蛋白或酶而具有吸收特異性[30]。但是，SPIO納米粒子被細(xì)胞吸收后聚集于溶酶體中，在溶酶體低的pH環(huán)境里，被分解成為鐵粒子，可用于合成血紅蛋白，因而在體內(nèi)具有低的毒性[31]。1.2課題的提出綜上所述，單一模態(tài)的磁共振對比劑，雖然在常見疾病的診斷上已經(jīng)發(fā)揮出巨大的作用，但是對于一些微小隱匿病變?nèi)匀粺o法提供具有高診斷準(zhǔn)確性的MRI圖像。而且單模態(tài)對比劑毒性大，在體內(nèi)會產(chǎn)生非特異性聚集，使非病變組織產(chǎn)生增強(qiáng)的MR信號，從而導(dǎo)致高的非特異性背景和低目標(biāo)背景比。因此，單模態(tài)的磁共振對比劑正面臨巨大的挑戰(zhàn)?；诖耍覀兲岢鰧㈥幮猿槾判约{米粒子氧化鐵對比劑和陽性PEG-Gd2O3對比劑相結(jié)合的可激活磁共振對比劑?？杉せ顚Ρ葎┚哂懈叱谠ヂ?、細(xì)胞毒性小、靶向性好、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)。目前，關(guān)于可激活對比劑的報道并不多，因此可激活對比劑成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。SPIO和PEG-Gd2O3表面都含有羧基（CO）,通過表面含有兩個氨基（NH）的胱胺相連接，當(dāng)沒有腫瘤細(xì)胞存在時，由于SPIO產(chǎn)生的磁場對PEG-Gd2O3的磁共振信號有淬滅作用，在磁共振T1圖像上沒黑色或灰黑色，當(dāng)有腫瘤細(xì)胞存在時，由于腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）含量比正常細(xì)胞高出許多，谷胱甘肽將連接SPIO和PEG-Gd2O3的雙硫鍵打開，在磁共振T1圖像上表現(xiàn)為明亮或白色信號。從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤的靶向作用。提高診斷的準(zhǔn)確信和特異性。1.3論文結(jié)構(gòu)和各章節(jié)安排論文第一章簡要介紹了本實(shí)驗(yàn)的研究背景，且闡述了本文研究內(nèi)容的提出。論文第二章對陽性對比劑PEG-Gd2O3和陰性對比劑SPIO以及“連接物”胱胺的合成方法、性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的闡述和介紹。論文第三章討論了可激活對比劑Fe3O4-SS-Gd2O3的制備過程及優(yōu)化。論文第四章進(jìn)行了可激活對比劑Fe3O4-SS-Gd2O3的細(xì)胞毒性研究，利用MTT法考察其生物相容性。論文第五章：總結(jié)與展望。2材料合成2.1四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子合成2.1.1引言氧化鐵(通常指磁鐵礦Fe3O4或者磁赤鐵礦γ－Fe2O3)納米粒子，應(yīng)用于磁共振成像已有20多年的歷史了。超順磁性氧化鐵(SPIO，粒徑小于30nm)納米粒子網(wǎng)狀內(nèi)皮組織吸收，在肝、脾、骨髓等組織會器官處富集會大大縮短T2弛豫時間，SPIO作為T2造影劑的典型代表，已經(jīng)臨床多年，如FeridexIVResovistLumirem進(jìn)行肝臟造影、追蹤成像等[32-36]。近年來，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，四氧化三鐵納米顆粒作為功能材料，在磁記錄材料、特殊催化劑原料、磁流體的基本材料和磁性顏料、藥物等方面顯示出許多特殊功能，有關(guān)納米磁性Fe3O4的制備方法及性質(zhì)的研究也受到廣泛關(guān)注。SPIO納米粒子的合成方法有許多種，常用的有共沉淀法、微乳液法、超聲空氣法等[37-38]。其中，共沉淀法是制備SPIO納米粒子最常規(guī)的方法，也是較為簡單和技術(shù)成熟的方法，它是將二價鐵鹽和三價鐵鹽溶液按一定比例混合，將堿性沉淀劑快速加入至上述混合溶液中，攪拌、反應(yīng)一段時間經(jīng)洗滌、干燥，可得SPIO粉末。SPIO為符合氧化物，是由相應(yīng)的氫氧化物轉(zhuǎn)化而來，因此該反應(yīng)的理論摩爾比為Fe2+：Fe3+：OH=1.00：2.00：8.00，但是由于實(shí)反應(yīng)中二價鐵離子易氧化成三價鐵離子，所以實(shí)際反應(yīng)中二價鐵離子應(yīng)當(dāng)適當(dāng)過量[39]。本文在制備Fe3O4的基礎(chǔ)上，又對已經(jīng)制備的納米探針進(jìn)行了TEM掃描，磁共振信號響應(yīng)，傅里葉紅外光譜分析以檢驗(yàn)制備的納米粒子是否符合作為對比劑的要求。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材（1）所用材料：試劑：二氯化鐵FeCl2（上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)二廠）；三氯化鐵FeCl3（滬試，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨水（滬試，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬三鈉（滬試，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）溴化鉀。材料：EP管、移液器槍頭、一次性吸管（美國AXYGEN公司）（2）所用器材：智能恒溫定時磁力攪拌器，型號：B12-3（上海司樂儀器有限公司）；超純水儀（美國，Milli-QRefereme）；舒美超聲波清洗器，型號：KQ218（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；10μL、20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德國Eppendorf公司）；電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；精密增力電動攪拌器，型號：JJ-1（常州國華電器有限公司）；紅外光譜儀，型號：NEXUS870（美國Nicolet公司）；透射電子顯微鏡TECNAIG2，（美國FEI公司）；3.0Tsignal全身磁共振成像設(shè)備，（美國GE公司）。2.1.3實(shí)驗(yàn)步驟（1）稱取0.19882gFeCl2溶于10mL蒸餾水，稱取0.54058gFeCl3溶于10mL蒸餾水，并用超聲儀將之混合均勻；（2）用一次性吸管將混合均勻的兩溶液加入三口燒瓶中，30度水浴加熱；（3）在機(jī)械攪拌作用下，用恒壓滴液漏斗慢慢將3.5mL濃氨加入；（4）氨水加完后，繼續(xù)劇烈攪拌30min，在滴加氨水的過程中，可以看到溶液的顏色由橘紅色逐漸變黑色；（5）用磁鐵將Fe3O4納米粒子吸出，用雙蒸水純化，直到PH=7.0；（6）在60攝氏度下真空干燥24小時，研磨得到Fe3O4納米粒子。2.1.4透射電子顯微鏡（TEM：Transmissionelectronmicroscope）掃描將SPIO納米粒子用雙蒸水配制成100μg/mL的納米溶液，超聲使其分散均勻，各取1滴置于銅網(wǎng)上，室溫晾干，于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。SPIO納米粒子的TEM下的形態(tài)如圖2.2。 圖2.1Fe3O4被磁鐵吸引圖2.2Fe3O4的TEM圖像從圖2.1，我們可以看出，制備的Fe3O4被磁鐵吸引，具有較強(qiáng)的磁性。從圖2.2可以看出，F(xiàn)e3O4整體呈類圓形分布，大小均勻的灰色顆粒，較分散，有少許團(tuán)聚現(xiàn)象，團(tuán)聚的納米粒子呈黑色。隨機(jī)選擇20個納米粒子進(jìn)行測量，用NanoMeasurer軟件，計算平均粒徑，可得到下圖2.3的粒徑分布。圖2.3Fe3O4納米粒子粒徑分布圖從圖2.3可以看出，隨機(jī)選擇的20個納米粒子的尺寸最大值為16.96nm，最小值為12.08nm，用NanoMeasurer軟件，計算平均粒徑為14.05nm，在納米材料的粒徑范圍之內(nèi)。2.1.5ICP-MS制樣將500μL0.24mg/mL的Fe3O4溶液，與500μL的濃硝酸（HNO3）混合，并在80℃環(huán)境下加熱30min。再取6mL的濃硝酸與78mL的水配成84mL5%的稀硝酸。在四氧化三鐵和濃硝酸的混合溶液中加入25mL稀硝酸。所得樣品送到南京大學(xué)分析測試中心用ICP-MS儀器檢測0.24mg/mL的Fe3O4溶液中Fe3+濃度。2.1.6MR掃描（1）不同濃度Fe3O4納米粒子溶液的制備首先稱取1.92mg制備好的Fe3O4、3.84mg檸檬酸三鈉，將兩者加入8mL的蒸餾水，充分混合均勻，得到0.24mg/mL的Fe3O4NPs。取0μL、1.25μL、2.5μL、3.75μL、5μL、6.25μL、7.5μL、8.75μL、10μL、11.25μL、12.5μL的0.24mg/mL的Fe3O4NPs分別溶于300μL、298.75μL、297.5μL、296.25μL、295μL、293.75μL、292.5μL、291.25μL、290μL、288.75μL、287.5μL的蒸餾水中，用超聲混合均勻，得到濃度分別為0mmol/L、0.005mmol/L、0.01mmol/L、0.016mmol/L、0.021mmol/L、0.032mmol/L、0.037mmol/L、0.043mmol/L、0.048mmol/L、0.053mmol/L的Fe3O4納米粒子溶液。（2）MR掃描條件設(shè)置采用頭顱8通道相控線圈，進(jìn)行T1加權(quán)成像（T2-weightedimaging,T2WI）掃描。MR掃描參數(shù)為：重復(fù)時間（Repetitiontime,TR）4500ms,回波時間（Echotime,TE）90.7ms，矩陣384×224，視野（Fieldofview,FOV）14cm×14cm，層厚2.0mm，層距0.2mm。（3）不同濃度Fe3O4納米粒子的磁共振信號響應(yīng)3.0TMRI掃描樣品的T2值如下表2.1。表2.1不同濃度Fe3O4納米粒子的磁共振信號響應(yīng)序號123457891011濃度0mM0.005mM0.01mM0.016mM0.021mM0.032mM0.037mM0.043mM0.048mM0.053mMT2550.59389.48278.59216.47180.50142.62119.91119.55105.4290.625根據(jù)表2.1，用Origin軟件做成下圖2.4。圖2.4Fe3O4NPsT2弛豫率測定從圖2.4我們看出，制備的Fe3O4納米粒子的弛豫率為164.5，與文獻(xiàn)中描述的相當(dāng)。且制備的Fe3O4納米粒子的T2弛豫率與濃度呈梯度關(guān)系。表明制備的Fe3O4納米粒子具有優(yōu)良的MRI對比增強(qiáng)能力，可以用作對比劑使用。2.1.7傅里葉變換紅外光譜分析取少量（約10μL）Fe3O4納米粒子和一定量的溴化鉀，置于電熱恒溫干燥箱中60℃干燥10分鐘之后取出，研磨使之混合均勻，壓成一薄片進(jìn)行測量。波長范圍為500-4000cm-1。紅外光譜分析的結(jié)果用Origin作圖，可得下圖2.5。圖2.5Fe3O4紅外光譜圖圖2.5中顯示Fe3O4在3441cm-1處有一較強(qiáng)的吸收峰，其代表OH的伸縮振動峰，而在1591cm-1處的吸收峰是C=O的伸縮振動峰，兩者皆是Fe3O4表面羧基官能團(tuán)的紅外特征吸收峰，說明Fe3O4表面存在羧基。2.2PEG-Gd2O3合成2.2.1引言MRI是臨床診斷及臨床前研究的領(lǐng)先技術(shù)，它成像無組織器官深度局限性，無電離輻射，可多參數(shù)多平面成像。但是，由于缺乏高弛豫率、低毒或無毒、體內(nèi)循環(huán)時間最優(yōu)的理想對比劑，磁共振在診斷具有特定的分子標(biāo)志物的病變方面及監(jiān)測藥物治療效應(yīng)方面受到了極大的限制。目前臨床使用的MRI對比劑Gd-DTPA弛豫率低、體內(nèi)毒性強(qiáng)，所以隨著磁共振應(yīng)用范圍的不斷增加，臨床對特異性的磁共振對比劑的需求越來越強(qiáng)烈。近年來，分子影像學(xué)取得了巨大的發(fā)展，靶向傳遞能夠增加對比增強(qiáng)的有效性、減少劑量和毒性，是一種能滿足影像診斷需求的良好策略。因此，靶向特異性的磁共振對比劑的研發(fā)是十分必要的。目前，已有研究證明氧化釓納米顆粒具有比目前廣泛使用的釓螯合劑更高的弛豫效能?；谘趸徏{米顆?？梢杂米鱐1對比劑，增強(qiáng)信號強(qiáng)度，這一研究吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注，引起了廣泛的研究興趣。氧化釓納米顆粒不僅可以增強(qiáng)對比效果，而且提供與修飾物連接的可能。在本文章中，選擇研究較成熟的PEG-Gd2O3作為陽性對比劑，討論了PEG-Gd2O3的制備及對MRI信號響應(yīng)做了評價[40]。2.2.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材（1）所用材料：試劑：硝酸釓（北京百靈威科技有限公司）；聚乙二醇二羧酸poly(ethyleneglycol)。材料：EP管、移液器槍頭、一次性吸管（美國AXYGEN公司）（2）所用器材：超純水儀（美國，Milli-QRefereme）；智能恒溫磁力攪拌器（上海予華儀器有限公司）；10μL、20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德國Eppendorf公司）；智能恒溫定時磁力攪拌器，型號：B12-3（上海司樂儀器有限公司）；電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；4℃冰箱，（中國海爾集團(tuán)）；紅外光譜儀，型號：NEXUS870（美國Nicolet公司）；3.0Tsignal全身磁共振成像設(shè)備，（美國GE公司）。2.2.3透析袋前處理透析袋前處理的基本方法：（1）把透析袋剪成適當(dāng)長度（10-20cm）的小段；（2）在1000mL的燒杯中加入2%（W/V）的碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA.2Na（PH=8）（稱取10g碳酸氫鈉和186.6mgEDTA.2Na溶于500mL蒸餾水，混合均勻），加入透析袋煮沸10分鐘；（3）用蒸餾水徹底清洗透析袋；（4）在1000mL的燒杯中加入1mmol/LEDTA.2Na（PH=8）（稱取186.6mgEDTA.2Na溶于500mL蒸餾水，混合均勻），在第（3）步中的透析袋加入進(jìn)去，煮沸10分鐘；（5）冷卻后，置于50%的酒精中，放于4℃冰箱，確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。2.2.4實(shí)驗(yàn)步驟（1）稱取0.4062g硝酸釓加入三口燒瓶中，注意不要沾到燒瓶壁上；（2）在三口燒瓶中滴加10mL聚乙二醇二羧酸poly(ethyleneglycol)，混合均勻；（3）用恒溫磁力攪拌器加熱到90-100℃，得到澄清溶液；（4）升溫到140℃加熱1小時；（5）繼續(xù)升溫到180℃加熱4小時；（6）將冷卻的溶液加入到之前準(zhǔn)備好的透析袋中，在2000mL的大燒杯中透析3天，每8小時換一次水（蒸餾水）；（7）將透析好的PEG-Gd2O3裝入50mL的離心管中，放入4℃冰箱備用。2.2.5MR掃描根據(jù)文獻(xiàn)，氧化釓納米材料的弛豫率比目前臨床使用的Gd-DTPA高，為了討論Gd-DTPA和PEG-Gd2O3的弛豫率高低，分別把PEG-Gd2O3和Gd-DTPA配成10個不同濃度進(jìn)行3.0TMRI掃描。（1）不同濃度Gd-DTPA溶液的制備首先取10個1.5mL的EP管，分別編號為1—10。在10個EP管中,分別加入360μLGd-DTPA、240μL蒸餾水，240μLGd-DTPA、360μL蒸餾水，120μLGd-DTPA、480μL蒸餾水，60μLGd-DTPA、540μL蒸餾水，48μLGd-DTPA、552μL蒸餾水，36μLGd-DTPA、564μL蒸餾水，24μLGd-DTPA、576μL蒸餾水，12μLGd-DTPA、588μL蒸餾水，6μLGd-DTPA、594μL蒸餾水，1.2μLGd-DTPA、598.8μL蒸餾水，總量均為600μL。分別制成濃度為3mmol/L、2mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0.4mmol/L、0.3mmol/L、0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.01mmol/L的Gd-DTPA溶液。（2）不同濃度PEG-Gd2O3溶液的制備配制不同濃度PEG-Gd2O3：首先取10個1.5mL的EP管，分別編號為1—10。在10個EP管中,分別加入600μLPEG-Gd2O3，300μLPEG-Gd2O3、300μL蒸餾水，240μLPEG-Gd2O3、360μL蒸餾水，180μLPEG-Gd2O3、420μL蒸餾水，120μLPEG-Gd2O3、480μL蒸餾水，60μLPEG-Gd2O3、540μL蒸餾水，30μLPEG-Gd2O3、570μL蒸餾水，12μLPEG-Gd2O3、588μL蒸餾水，6μLPEG-Gd2O3、594μL蒸餾水，3μLPEG-Gd2O3、597μL蒸餾水，總量均為600μL。分別制成濃度為0.3mmol/L、0.15mmol/L、0.12mmol/L、0.09mmol/L、0.06mmol/L、0.03mmol/L、0.015mmol/L、6μmol/L、3μmol/L、1.5μmol/L的PEG-Gd2O3溶液。將不同濃度的Gd-DTPA和不同濃度的PEG-Gd2O3進(jìn)行MRI掃描，MRI掃描條件設(shè)置同2.1.5。所得的T1弛豫時間用Origin軟件做成下圖2.6。圖2.6不同濃度PEG-Gd2O3及Gd-DTPA的磁共振響應(yīng)從圖2.6可以看出兩點(diǎn)：首先不同濃度PEG-Gd2O3的T1弛豫時間的回歸方程為：y=0.48056+29.00451x，弛豫率為：29.00451。不同濃度Gd-DTPA的T1弛豫時間的回歸方程為：y=0.4892+4.20993x，弛豫率為4.20993。也就是說，PEG-Gd2O3的T1弛豫率是目前使用的Gd-DTPAT1弛豫率的七倍多。弛豫率越高。成像效果越好。為了得到同樣具有診斷價值的圖像，所需PEG-Gd2O3的濃度僅為Gd-DTPA的七分之一，所需對比劑的量大大減少，降低了細(xì)胞毒性，減少對人體的傷害。其次PEG-Gd2O3磁共振信號按濃度呈現(xiàn)梯度性響應(yīng)并且其弛豫率達(dá)到29.00451，表明制備的PEG-Gd2O3納米粒子具有優(yōu)良的MRI對比增強(qiáng)能力，可以用作對比劑使用。2.2.6傅里葉變換紅外光譜分析取少量（約10μL）PEG-Gd2O3和一定量的溴化鉀，置于電熱恒溫干燥箱中60℃干燥10分鐘之后取出，研磨使之混合均勻，壓成一薄片進(jìn)行測量，波長范圍為500-4000cm-1。紅外光譜分析的結(jié)果用Origin作圖，可得下圖2.7。圖2.7PEG-Gd2O3紅外光譜圖圖2.7顯示PEG-Gd2O3在1616cm-1處的吸收峰是C=O的伸縮振動峰,PEG鏈上的C-O-C和C-H的伸縮振動峰分別出現(xiàn)在1100cm-1和2867cm-1處，1451cm-1、1349cm-1、1250cm-1處的吸收峰是由于CH2的伸縮振動導(dǎo)致的。PEG-Gd2O3制備成功。2.3胱胺合成2.3.1引言胱胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)很特殊，其表面含有有個氨基（NH）和一個雙硫鍵，四氧化三鐵和氧化釓表面都含有羧基（CO），通過胱胺表面的兩個氨基可以把四氧化三鐵和氧化釓連在胱胺的兩邊。中間通過雙硫鍵連接，由于雙硫鍵的特殊結(jié)構(gòu)，其可以被在腫瘤組織中高表達(dá)的谷胱甘肽及強(qiáng)還原物質(zhì)打開，在體內(nèi)只能被谷胱甘肽打開，所以可以用于人體用于對腫瘤的特異性診斷。當(dāng)雙硫鍵沒有被打開時，由于四氧化三鐵產(chǎn)生的強(qiáng)磁場對氧化釓的淬滅作用，MRIT1為黑色或灰色，但當(dāng)雙硫鍵被GSH打開時，T1信號變明亮，則提示腫瘤組織的存在。其作用原理如下圖2.8。圖2.8可激活MRI納米探針作用原理圖2.3.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材（1）所用材料：試劑：半胱胺酸（北京百靈威科技有限公司）；氫氧化鈉（滬試，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二氯甲烷（滬試，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。材料：EP管、移液器槍頭、一次性吸管（美國AXYGEN公司）（2）所用器材：超純水儀（美國，Milli-QRefereme）；智能恒溫定時磁力攪拌器，型號：B12-3（上海司樂儀器有限公司）；10μL、20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德國Eppendorf公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，型號：RE-52AA，（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；舒美超聲波清洗器，型號：KQ218（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平，（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；4℃冰箱，（中國海爾集團(tuán)）。2.3.3實(shí)驗(yàn)步驟（1）稱取1.7g半胱胺酸和0.88g氫氧化鈉，溶于300mL蒸餾水，超聲使之混合均勻；（2）常溫下磁力攪拌30分鐘得到透明液體；（3）按照1:1的比例?。?）中制好的液體和二氯甲烷在分液漏斗中進(jìn)行粹取（混勻、放氣連續(xù)三次），粹取完的液體分成兩層（一層水相，一層油相），收集下面的二氯甲烷在30℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；（4）重復(fù)（3）直到所有（2）制好的液體粹取蒸發(fā)完，得到淡黃色透明液體，即胱胺。2.4討論本實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)沉淀法制備Fe3O4納米粒子，并通過透射電鏡、MRI響應(yīng)、傅里葉紅外光譜分析對制備的Fe3O4納米粒子的特性進(jìn)行表征；通過MRI響應(yīng)、傅里葉紅外光譜分析對制備的PEG-Gd2O3納米粒子的特性進(jìn)行表征；通過傅里葉紅外光譜分析對制備的胱胺進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Fe3O4納米粒子、PEG-Gd2O3納米粒子以及“連接物”胱胺制備成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3可激活MRI納米探針Fe3O4-SS-Gd2O3的制備為了確定可激活對比劑中四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子和氧化釓（PEG-Gd2O3）的最佳濃度，需要四氧化三鐵和氧化釓的濃度進(jìn)行優(yōu)化處理。用控制單一變量的方法，首先確定一個氧化釓的量，通過改變四氧化三鐵的濃度，配制溶液進(jìn)行MRI掃描，得到四氧化三鐵的最佳濃度；然后再同理按照上述方法，確定最佳氧化釓和谷胱甘肽的濃度。3.1Fe3O4-SS-Gd2O3的傅里葉變換紅外光譜分析為了驗(yàn)證Fe3O4表面及PEG-Gd2O3表面的羧基與胱胺上的氨基共價結(jié)合成Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針，我們將稀釋的Fe3O4-COOH、PEG-Gd2O3、Gd2O3-cystamine和Gd2O3-SS-Fe3O4納米探針進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析。紅外光譜分析的結(jié)果用Origin作圖，可得下圖3.1。圖3.1納米探針組裝的紅外光譜圖圖3.1中顯示PEG-Gd2O3與胱胺反應(yīng)后，出現(xiàn)游離的氨基，在3300-3500cm-1之間出現(xiàn)雙峰，同時羧基中的C=O向低頻移動，為酰氨鍵中的C=O，與Fe3O4-COOH進(jìn)一步結(jié)合后，游離的NH2消失，說明與Fe3O4上的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)。說明Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針共價組裝的成功制備。3.2不同濃度四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子對MRI信號的影響首先準(zhǔn)備PEG-Gd2O3-SS-NH2：取一定量的PEG-Gd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時。取5個1.5mL的EP管，編號為1—5，在其中都加入500μL的PEG-Gd2O3-SS-NH2；然后再分別在5個EP管中加入0.24mg/mL的Fe3O450μL（其中含F(xiàn)e3O40.012mg）、100μL（其中含F(xiàn)e3O40.024mg）、150μL（其中含F(xiàn)e3O40.036mg）、200μL（其中含F(xiàn)e3O40.048mg）、250μL（其中含F(xiàn)e3O40.06mg）；在用移液器分別在5個EP管中加入蒸餾水216.7μL、163.2μL、110μL、56.6μL、3.4μL，配成總量一定的5個溶液。用高速冷凍離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成5個Fe3O4濃度不同的Fe3O4-SS-Gd2O3溶液。為了便于對比分析，每個樣品分別配2管掃M(jìn)RI，其中一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mMGSH）。制成共10個樣品掃M(jìn)RI。結(jié)果如圖3.2。圖3.2不同濃度Fe3O4下GSH的MRI信號響應(yīng)從圖3.2可以看出，當(dāng)有谷胱甘肽存在時，磁共振信號比沒有谷胱甘肽時的磁共振信號亮度明顯增強(qiáng)，當(dāng)Fe3O4納米粒子的含量為0.036mg時，圖像的信噪比最大。所以，最終選擇的Fe3O4最佳濃度為0.24mg/mL150μL，也即四氧化三鐵質(zhì)量為0.036mg時，圖像信噪比最大，圖像質(zhì)量最高。3.3不同濃度氧化釓（PEG-Gd2O3）對MRI信號的影響首先也是準(zhǔn)備PEG-Gd2O3-SS-NH2：取一定量的PEG-Gd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），在37℃電熱恒溫水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育2小時。由于本實(shí)驗(yàn)中Fe3O4的量固定不變，所以EDC和NHS的量都不需改變。由3.2可知，四氧化三鐵的最佳濃度為：0.036mg，所以在討論氧化釓的最佳濃度時，四氧化三鐵的濃度取最佳濃度。又由于在3.1中對四氧化三鐵濃度優(yōu)化時，選擇氧化釓量為500μL，因此本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的氧化釓的濃度改變時必須包括500μL。然后取7個1.5mL的EP管，編號為1—7，在其中都加入150μL的0.24mg/mL的Fe3O4；然后分別在7個EP管中加入制備好的PEG-Gd2O3-SS-NH2100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、800μL；再用移液器分別在5個EP管中加入蒸餾水700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、0μL，配成總量一定的7個溶液。用高速冷凍離心機(jī)在10000轉(zhuǎn)每分的條件離心10min，倒掉上清液，并分別分散于500μL蒸餾水中，最終制成7個PEG-Gd2O3濃度不同的Fe3O4-SS-Gd2O3溶液。為了便于對比分析，每個樣品分別配2管掃M(jìn)RI，其中一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和10μL蒸餾水，另一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（10mMGSH）。制成共14個樣品掃M(jìn)RI。結(jié)果如圖3.3。圖3.3不同濃度PEG-Gd2O3下GSH的MRI信號響應(yīng)從圖3.3可以看出，當(dāng)有谷胱甘肽存在時，磁共振信號比沒有谷胱甘肽時的磁共振信號明顯變明亮許多，當(dāng)PEG-Gd2O3為500μL時，圖像信噪比最大。所以認(rèn)為PEG-Gd2O3的最佳濃度為500μL，當(dāng)PEG-Gd2O3濃度為500μL時，圖像信噪比最大，圖像質(zhì)量最高。3.4谷胱甘肽（GSH）對T1弛豫率的影響按照3.1和3.2描述的方法制備Fe3O4-SS-Gd2O310mL，準(zhǔn)備14個0.5mL的EP管，分別編號為a1-a7（沒有谷胱甘肽）、p1-p7（有谷胱甘肽），在a1-a7中分別加入250μLFe3O4-SS-Gd2O3、10μL蒸餾水，200μLFe3O4-SS-Gd2O3、60μL蒸餾水，150μLFe3O4-SS-Gd2O3、110μL蒸餾水，100μLFe3O4-SS-Gd2O3、160μL蒸餾水，50μLFe3O4-SS-Gd2O3、210μL蒸餾水，25μLFe3O4-SS-Gd2O3、235μL蒸餾水，260蒸餾水。p1-p7中Fe3O4-SS-Gd2O3分別與a1-a7相同，并加入與a1-a7中與蒸餾水等量的0.26mM的GSH。3.0T磁共振掃描T1弛豫率的回歸方程如圖3.4。圖3.4GSH對不同濃度PEG-Gd2O3的MR信號T1弛豫率影響從圖3.4曲線可以看出，當(dāng)有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的MR信號T1弛豫時間的回歸方程為：y=0.62766+15.90626x，即有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的MR信號T1弛豫率為15.90626。然而，當(dāng)沒有谷胱甘肽時，不同濃度氧化釓的MR信號T1弛豫時間的回歸方程為：y=0.38554+5.73569x，即沒有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的MR信號T1弛豫率為5.73569。也就是說，有谷胱甘肽存在時的弛豫率是沒有谷胱甘肽時的近3倍，說明所制備的納米探針對谷胱甘肽有靈敏的MR響應(yīng)，有望用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH的MRI。3.5不同濃度谷胱甘肽（GSH）的MRI信號響應(yīng)同理制備Fe3O4-SS-Gd2O33mL，準(zhǔn)備12個0.5mL的EP管，編號為1-12，在12個EP管中都加入150μLFe3O4-SS-Gd2O3，1-12號EP管中分別加入110μL蒸餾水,109μL蒸餾水、0.5μL0.26MGSH、109.5μL蒸餾水，1μL0.26MGSH，2μL0.26MGSH、108μL蒸餾水，3μL0.26MGSH、107μL蒸餾水，4μL0.26MGSH、106μL蒸餾水，5μL0.26MGSH、105μL蒸餾水，6μL0.26mMGSH、104μL蒸餾水，7μL0.26MGSH、103μL蒸餾水，8μL0.26MGSH、102μL蒸餾水，9μL0.26MGSH、101μL蒸餾水，10μL0.26MGSH、100μL蒸餾水制成總量為260μL的12個樣品。3.0T磁共振掃描的T1弛豫率的回歸方程如圖3.5。圖3.5不同濃度GSH的MRIT1弛豫率由于腫瘤組織中GSH含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織，從圖3.5可以看出，當(dāng)GSH濃度大于等于4mmol/L時，T1弛豫時間改變明顯，文獻(xiàn)記載腫瘤組織的GSH含量大于5mmol，而正常組織中GSH的含量約為0.5mmol。因此可激活納米探針可以把腫瘤組織和正常組織區(qū)分開。達(dá)到特異性診斷腫瘤的目的。3.6討論本章節(jié)首先通過控制單一變量的方法對制備的可激活磁共振對比劑Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針的濃度進(jìn)行優(yōu)化，從而最終確定Fe3O4最佳濃度為0.24mg/mL150μL，PEG-Gd2O3的最佳濃度為500μL；然后通過比較有無谷胱甘肽存在時材料的MRI掃描T1弛豫率，數(shù)據(jù)表明當(dāng)有谷胱甘肽存在時，T1弛豫率明顯提高，對比效果更佳，且當(dāng)GSH濃度超過3mol/L時，弛豫率明顯改變，而腫瘤組織中GSH高表達(dá)，從而可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的特異性診斷；最后通過傅里葉紅外光譜分析對材料進(jìn)行表征并比較，證明可激活磁共振對比劑Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針制備成功。4可激活MRI納米探針Fe3O4-SS-Gd2O3的MTT測試隨著免疫學(xué)、血液學(xué)和腫瘤學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，科研部門和臨床醫(yī)院檢測各種細(xì)胞和細(xì)胞因子活性等方面的工作日益增多，但是其檢測方法多不盡人意。細(xì)胞毒性檢測的方法有很多種，如MTT法，CCK-8法，LDH法等。這些方法雖各具優(yōu)點(diǎn)，但都存在局限性。自從1983年美國學(xué)者M(jìn)osmamn建立了MTT比色法以來，以其快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)受到人們的普遍重視，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，例如檢測細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感性，刺激劑對免疫細(xì)胞的反應(yīng)、免疫細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子活性等[41]。因此本文選用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。MTT產(chǎn)品為淡黃色粉末，易被水溶解和透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可被活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍(lán)紫色甲躦（Formazam）結(jié)晶。該結(jié)晶可溶于酸性異丙醇、二甲亞砜、SDS等有機(jī)溶劑中，再通過酶標(biāo)儀依顏色深淺測定出各吸光度值。由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例，因此吸光度值的大小可反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量及活性。為了將制備得到的Fe3O4-SS-Gd2O3可激活對比劑用于腫瘤細(xì)胞的MRI診斷，首先利用MTT測試考察了該納米探針的生物相容性。4.1實(shí)驗(yàn)試劑及器材（1）所用試劑：乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC），（美國Sigma公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），（美國Sigma公司）；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司）；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司）；磷酸鹽緩沖液(PBS，自配)；MTT粉末；胰酶（美國Giboc公司）；二甲基亞砜(DMSO，美國PIERCE公司）。（1）所用器材：-80℃冰箱，(日本SANYO公司)；4℃冰箱，（中國海爾集團(tuán)）；-20℃冰箱，（中國海爾集團(tuán)）；培養(yǎng)板，（美國Corning公司）；培養(yǎng)瓶，（美國Corning公司）；15mL及50mL離心管，（美國Corning公司）；EP管，（美國AXYGEN公司）；漩渦混合器(XH-C)，（金壇市白塔新寶儀器廠）；20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德國Eppendorf公司）；移液器槍頭，（美國AXYGEN公司）；醫(yī)用凈化工作臺(YJ-1450D)，（蘇州凈化設(shè)備公司）；高速冷凍離心機(jī)，（美國Thermo公司）；低速離心機(jī)(KDC-40)，（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；電熱恒溫水槽(DK-8D)，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；倒置顯微鏡，（日本奧林巴斯公司）；倒置熒光相差顯微鏡，型號：DMI3000B（德國，徠卡儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；電熱恒溫干燥箱，（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；恒溫CO2培養(yǎng)箱，（美國Thermo公司）；立式壓力蒸汽滅菌器，型號LDZX—50KBS，（上海申安醫(yī)療儀器廠）。4.2NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)以下各項(xiàng)操作均在無菌細(xì)胞室進(jìn)行，NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃5%CO2培養(yǎng)箱。所用實(shí)驗(yàn)器材如4.1所示。4.2.1NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞復(fù)蘇（1）用具消毒：將培養(yǎng)細(xì)胞需要用到的培養(yǎng)瓶、槍頭高壓蒸汽滅菌30min，并放于電熱恒溫干燥箱干燥24小時后，取出置于超凈工作臺備用；（2）配制培養(yǎng)基：將RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗按照90%：10%：1%的比例配好備用；（3）將凍存的NIH3T3細(xì)胞從液氮中取出，快速放入37℃的恒溫水浴箱中，使之融化；（4）將融化的NIH3T3消毒放入超凈臺，用微量移液器將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，并加入配制好的培養(yǎng)基5—10mL；（5）將培養(yǎng)瓶放于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（6）24h后，棄除舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。4.2.2NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞傳代（1）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于80％-90％匯合階段時進(jìn)行傳代培養(yǎng)；（2）倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用5—10mL無菌PBS水洗滌1—2次，然后想瓶內(nèi)加入500μL0.25%的胰蛋白酶消解細(xì)胞；（3）室溫下放置1-3min，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮至細(xì)胞形態(tài)近圓形時，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培養(yǎng)基終止消解，輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從培養(yǎng)瓶中脫離，形成細(xì)胞懸液；（4）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10mL的離心管中，2000轉(zhuǎn)離心10min；（5）倒掉上清液，加入1mL培養(yǎng)基使細(xì)胞分散均勻，分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，一般1:3傳代，但是本實(shí)驗(yàn)由于時間有限，為了讓細(xì)胞快速生長，進(jìn)行1:2傳代。補(bǔ)充配置好的培養(yǎng)基5—10mL，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4.2.3NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞計數(shù)（1）用0.25%胰蛋白酶將貼壁的細(xì)胞消化下來，使之形成細(xì)胞懸液；（2）取計數(shù)用載玻片，蓋上蓋玻片，吸取少量細(xì)胞懸液滴到載玻片上，使載玻片與蓋玻片之間充滿細(xì)胞懸液；（3）倒置顯微鏡下計數(shù)載玻片上4個角的大計數(shù)格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。4.2.4NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞凍存（1）用胰蛋白酶消化細(xì)胞，脫壁后，立即用培養(yǎng)液中止消化，用巴氏吸管輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。（2）室溫下1000rpm離心5min。（3）加入適量的培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加1.5mL-2mL。（4）加入1/10體積的DMSO，混合均勻。（5）分裝至凍存管內(nèi)，并將凍存管置于保溫盒內(nèi)，置于4℃冰箱2小時，取出，置于-20℃冰箱2小時，取出，置于-80℃冰箱保存。4.3786-0腎癌細(xì)胞培養(yǎng)以下各項(xiàng)操作均在無菌細(xì)胞室進(jìn)行，NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃5%CO2培養(yǎng)箱。所用實(shí)驗(yàn)器材如4.1所示。4.3.1786-0腎癌細(xì)胞復(fù)蘇（1）用具消毒：將培養(yǎng)細(xì)胞需要用到的培養(yǎng)瓶、槍頭高壓蒸汽滅菌30min，并放于電熱恒溫干燥箱干燥24小時后，取出置于超凈工作臺備用；（2）配制培養(yǎng)基：將RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗按照90%：10%：1%的比例配好備用；（3）將凍存的786-0腎癌細(xì)胞從液氮中取出，快速放入37℃的恒溫水浴箱中，使之融化；（4）將融化的786-0腎癌細(xì)胞消毒放入超凈臺，用微量移液器將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，并加入配制好的培養(yǎng)基5—10mL；（5）將培養(yǎng)瓶放于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；（6）24h后，棄除舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。4.3.2786-0腎癌細(xì)胞傳代（1）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于80％-90％匯合階段時進(jìn)行傳代培養(yǎng)；（2）倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用5—10mL無菌PBS水洗滌1—2次，然后想瓶內(nèi)加入500μL0.25%的胰蛋白酶消解細(xì)胞；（3）室溫下放置1-3min，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮至細(xì)胞形態(tài)近圓形時，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培養(yǎng)基終止消解，輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從培養(yǎng)瓶中脫離，形成細(xì)胞懸液；（4）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10mL的離心管中，2000轉(zhuǎn)離心10min；（5）倒掉上清液，加入1mL培養(yǎng)基使細(xì)胞分散均勻，分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，一般1:3傳代，但是本實(shí)驗(yàn)由于時間有限，為了讓細(xì)胞快速生長，進(jìn)行1:2傳代。補(bǔ)充配置好的培養(yǎng)基5—10mL，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4.3.3786-0腎癌細(xì)胞計數(shù)（1）用0.25%胰蛋白酶將貼壁的細(xì)胞消化下來，使之形成細(xì)胞懸液；（2）取計數(shù)用載玻片，蓋上蓋玻片，吸取少量細(xì)胞懸液滴到載玻片上，使載玻片與蓋玻片之間充滿細(xì)胞懸液；（3）倒置顯微鏡下計數(shù)載玻片上4個角的大計數(shù)格(每個角16格)內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)(計數(shù)原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，細(xì)胞團(tuán)塊算1個細(xì)胞)；（4）按下式計算細(xì)胞濃度和細(xì)胞總數(shù)：細(xì)胞濃度=(四格細(xì)胞數(shù)和/4)×104(個/mL)細(xì)胞總數(shù)＝(四格細(xì)胞數(shù)和/4)×104×細(xì)胞懸液總體積(個)4.3.4786-0腎癌細(xì)胞凍存（1）用胰蛋白酶消化細(xì)胞，脫壁后，立即用培養(yǎng)液中止消化，用巴氏吸管輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。（2）室溫下1000rpm離心5min。（3）加入適量的培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加1.5mL-2mL。（4）加入1/10體積的DMSO，混合均勻。（5）分裝至凍存管內(nèi)，并將凍存管置于保溫盒內(nèi)，置于4℃冰箱2小時，取出，置于-20℃冰箱2小時，取出，置于-80℃冰箱保存。4.4NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞、786-0腎癌細(xì)胞種板在做MTT測試之前，要將786-0腎癌細(xì)胞及NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞種到96孔細(xì)胞板中，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時之后待細(xì)胞貼壁長滿才可以進(jìn)行加材料MTT測試等實(shí)驗(yàn)。以下各項(xiàng)操作均在無菌細(xì)胞室進(jìn)行，所用實(shí)驗(yàn)器材如4.1所示。NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞種板的實(shí)驗(yàn)步驟為：（1）倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，用5—10MLPBS水洗滌一下,倒掉PBS水，加入500μL0.25%的胰蛋白酶消解細(xì)胞；（2）室溫下放置1-3min，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮至細(xì)胞形態(tài)近圓形時，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培養(yǎng)基終止消解，輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從培養(yǎng)瓶中脫離，形成細(xì)胞懸液；（3）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到10mL的離心管中，2000轉(zhuǎn)離心10min；（4）倒掉上清液，加入1mL培養(yǎng)基，用力振蕩，使細(xì)胞分散均勻；（5）將（4）中細(xì)胞與培養(yǎng)基的混合液轉(zhuǎn)移到50mLEP管中，繼續(xù)加入14mL培養(yǎng)基，混合均勻；（6）用移液器將（5）中細(xì)胞與培養(yǎng)基的混合液種到96孔細(xì)胞板中，每孔加200μL，在種板過程中，注意及時混勻細(xì)胞與培養(yǎng)基，防止種板不均勻；（7）將種好的細(xì)胞板置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。786-0腎癌細(xì)胞的種板實(shí)驗(yàn)過程與NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞種板相似，此處不再贅述。待細(xì)胞全都貼壁長滿之后，將制備好的Fe3O4-SS-Gd2O3可激活對比劑按照表4.1中對比劑與培養(yǎng)基的量加入細(xì)胞板。表4.1MTT測試之加材料表序號培養(yǎng)基Fe3O4-SS-Gd2O3材料濃度A1-A12100μL0μL0mM[Gd]B1-B698.3μL1.7μL3mM[Gd3+]0.05mM[Gd]B7-B1297.3μL2.7μL3mM[Gd3+]0.08mM[Gd]C1-C696.7μL3.3μL3mM[Gd3+]0.1mM[Gd]C7-C1295μL5μL3mM[Gd3+]0.15mM[Gd]D1-D693.3μL6.7μL3mM[Gd3+]0.2mM[Gd]D7-D1290μL10μL3mM[Gd3+]0.3mM[Gd]NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞板加材料的實(shí)驗(yàn)步驟為：（1）制備0.3mM[Gd3+]，3mM[Gd3+]：首先準(zhǔn)備PEG-Gd2O3-SS-NH2：取5mL的PEG-Gd2O3和2.5mgEDC，在37℃電熱恒溫水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的NHS和100μL胱胺，繼續(xù)孵育2小時。準(zhǔn)備Fe3O4-SS-Gd2O3：取1.5mL的0.24mg/mLFe3O4和4.5mgEDC、1.2mL蒸餾水，在37℃電熱恒溫水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入與EDC等量的NHS，繼續(xù)孵育2小時。將3mM[Gd3+]稀釋10倍即得到0.3mM[Gd3+]。（2）用移液器將細(xì)胞板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入200μLPBS水洗滌，吸出PBS，按照表二加Fe3O4-SS-Gd2O3和培養(yǎng)基。786-0腎癌細(xì)胞的加材料實(shí)驗(yàn)過程與NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞種板相似，此處不再贅述。4.5MTT測試將材料與細(xì)胞培養(yǎng)24h后，用倒置熒光顯微鏡拍攝出不同濃度下細(xì)胞的生長狀態(tài)，然后把培養(yǎng)基移除，將MTT混合液（8mgMTT粉溶于1.6mLPBS和6.4mL不含血清的培養(yǎng)基，超聲使其混合均勻）加入每個細(xì)胞孔中，孵育4h后，用BioTek公司的680酶標(biāo)儀通過測量溶液的吸光度來檢測細(xì)胞的相應(yīng)能力。光學(xué)密度（OD）在波長為490nm時被讀取，相應(yīng)的細(xì)胞能力被表達(dá)為：（[OD]test/[OD]control）×100%。4.5.1786-0腎癌細(xì)胞形態(tài)表征如圖4.1所示將不同濃度的Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針與腎癌細(xì)胞786-0作用24h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。圖4.1不同濃度Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針與786-0作用24h后的細(xì)胞形態(tài)圖4.1中隨著材料濃度的增加，細(xì)胞的形態(tài)并未發(fā)生明顯的改變，當(dāng)Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針中[Gd3+]濃度低于0.2mM時，細(xì)胞形態(tài)均未發(fā)生明顯變化，786-0腎癌細(xì)胞具有良好的細(xì)胞形態(tài)，由此說明Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針具有良好的生物相容性，可用于腫瘤細(xì)胞的成像診斷研究。4.5.2786-0腎癌細(xì)胞存活率測定采用MTT法定量評估Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針對細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖4.2所示。圖4.2786-0腎癌細(xì)胞存活率圖4.2中表明在Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針中[Gd3+]濃度低于0.1mM時，細(xì)胞的存活率均在90%以上，當(dāng)[Gd3+]濃度高于0.15mM時，細(xì)胞存活率明顯降低。說明Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針具有良好的生物相容性，可作為MRI對比劑用于腫瘤細(xì)胞的MRI診斷。4.6討論本章節(jié)利用MTT法考察了Fe3O4-SS-Gd2O3納米材料的生物相容性。將納米探針分別與腎癌細(xì)胞786-0和NIH-3T3細(xì)胞作用，利用倒置電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，然后進(jìn)行MTT測試，用酶標(biāo)儀計算細(xì)胞存活率從而得出：該納米探針在低濃度下對腫瘤細(xì)胞的毒性比較小，當(dāng)[Gd]濃度高于0.15mM時，細(xì)胞存活率降低。因此，F(xiàn)e3O4-SS-Gd2O3納米材料的生物相容性較好。但是，由于小鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3種板不均勻，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，F(xiàn)e3O4-SS-Gd2O3納米材料對正常細(xì)胞的毒性還不得而知。5總結(jié)與展望5.1總結(jié)本文討論了陽性對比劑氧化釓及陰性對比劑四氧化三鐵的制備及對其性質(zhì)進(jìn)行了簡單的研究。然后通過胱胺將兩者連接形成可激活對比劑Fe3O4-SS-Gd2O3，可激活對比劑與目前臨床應(yīng)用最廣泛的釓劑相比，具有弛豫率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)有腫瘤細(xì)胞存在時，可激活對比劑的雙硫鍵被打開，MRI信號增強(qiáng)，提高了腫瘤診斷的特異性與準(zhǔn)確性。本文也通過MTT方法對制備的可激活對比劑進(jìn)行生物相容性的研究，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)Fe3O4-SS-Gd2O3納米探針中[Gd]濃度低于0.1mM時，細(xì)胞存活率較高，生物相容性較好。5.2展望本文僅僅討論了尺寸為的四氧化三鐵納米粒子應(yīng)用于可激活對比劑的成像效果研究，對于不同尺寸的四氧化三鐵的研究還處于制備材料階段。根據(jù)文獻(xiàn)描述的方法，用同2.1相同的化學(xué)沉淀法制備3個樣品：1號樣品為在0.198gFeCl2和0.541gFeCl3加入3.5mL濃氨制成；2號樣品為在0.9941gFeCl2和2.7029gFeCl3加入5mL濃氨制成；3號樣品為在0.9941gFeCl2和2.7029gFeCl3加入3.6mL濃氨制成。樣品如下圖5.1。圖5.13號樣品-鐵均被磁鐵吸引從圖5.1中可以看到，3號樣品的磁性均很強(qiáng)，但是，做水和粒徑發(fā)現(xiàn)3號樣品的粒徑分別為145nm、133nm、134nm，差別不是很大，無法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所以，我們又選擇另外一種方法制備Fe3O4納米粒子。首先配制氫氧化鈉（NaOH）/DEG原液：稱取2gNaOH溶于20mLDEG在氮?dú)鈼l件下加熱到120℃、1小時，然后冷卻至70℃并保持此溫度；稱取8gPAA(PolyacrylicAcid)和0.0648gFeCl3溶于17mLDEG在氮?dú)鈼l件下加熱到220℃機(jī)械攪拌30分鐘得到透明黃色液體；然后將1mLNaOH/DEG原液加入到透明黃色液體中（通過加入不同體積的NaOH/DEG原液以達(dá)到制備不同尺寸Fe3O4納米粒子的目的），將溫度降至210℃，溶液慢慢變黑，繼續(xù)在氮?dú)鈼l件下恒溫加熱1小時。加熱完全后，取出粘稠黑色溶液冷卻至常溫，用50%的乙醇洗滌，得到如下圖5.2較透明的溶液。圖5.2樣品未被磁鐵吸引從圖5.2中可以看出，洗滌之后的液體中完全沒有磁性物質(zhì)，因此，本實(shí)驗(yàn)失敗，沒有合成Fe3O4納米粒子。究其原因，主要有以下幾點(diǎn)：首先，有可能是加入的NaOH/DEG原液的量太少，不足以反應(yīng)出Fe3O4納米粒子；其次，本實(shí)驗(yàn)需要使用四頸燒瓶，一個通氮?dú)?，一個通冷凝水，一個機(jī)械攪拌，一個放溫度計，但是由于沒有四頸燒瓶，所以必須“一頸兩用”，“兩用”的過程中可能會有氧氣進(jìn)入反應(yīng)瓶中，發(fā)生還原反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。因此，實(shí)驗(yàn)的下一步計劃是繼續(xù)嘗試合成不同尺寸的Fe3O4納米粒子與PEG-Gd2O3相連接，并研究它們的性質(zhì)與不同，以確定可激活對比劑中的Fe3O4納米粒子最佳尺寸。同時，本論文現(xiàn)階段主要完成了可激活對比劑的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，還需進(jìn)一步研究其體外腫瘤細(xì)胞的靶向成像及在體實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[1]曾益新．腫瘤學(xué)，第二版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：[2]JemalA,SiegelR,XuJ,etal.Cancerstatistics,2010.CACancerJClin,2010,6(5):277-300.[3]韓曉群,李著華,張敬各等.降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度對乳腺癌細(xì)胞阿霉素敏感性的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2007,38(5):770-774.DOI:10.3969/j.issn.1672-173X.2007.05.005.[4] WeisslederR.Molecularimaging:exploringthenextfrontier.Radiology[J].1999, 212(3):609-614.[5] RudinM,WeisslederR.Molecularimagingindrugdiscoveryanddevelopment [J].NatRevDrugDiscov,2003,2(2):123-131.[6]WeisslederR.Molecularimagingincancer[J].Science.2006,312(5777):1168-1171.[7]StasinopoulosI,PenetMF,KrishnamacharyB,etal.Molecularandfunctionalimagingofinvasionandmetastasis:windowsintothemetastaticcascade.CancerBiomark,2010,7(4):173-188.[8]LeeS,XieJ,ChenX.Activatablemolecularprobesforcancerimaging.CurrTopMedChem,2010,10(11):1135-1144.[9]CaravanE，E11isonJ．J．，McMurryT．J．，LaufferR．B．，ChemicalReviews們，1999，99(9):352．[10]LaufferR．B．，MagneticResonanceQuarterly[J]，1990，6(2)：65-84．[11] 郡國平，卓仁禧.科學(xué)通報[J]，2001，46(7)：531.[12]LauterburPC.Geophysics:Volcanomagnetism[J].Nature,1973,242,190-190.[13]CARAVANPStrategiesforincreasingthesensitivityofgadoliniumbasedMRIcontrastagents,2006,06.[14]KIELARF，TEIL，TERRENOELargerelaxivityenhancementofparamagneticlipidnanoparticlesbyrestrictingthelocalmotionsoftheGdIIIchelates,2010:23[15]ARBABAS，LIUW，F(xiàn)RANKJACellularmagneticresonanceimaging:currentstatusandfutureprospects,2006,4.[16]TSAIZT，TSAIFY，YANGWC，eta1．PreparationandCharacterizationofFerrofluidStabilizedwithBioeompatibleChitosanandDextranSulfateHybridBiopolymerasaPotentialMagneticResonanceImaging(MRI)T2ContrastAgent[J]．MarineDrugs，2012，10(11):2403-2414．[17] WeinmannHJ,BraschRC,PressWR.AmJRoentgenol,1984,142,6192.[18] 何國祥,王毅翔.造影劑藥理學(xué)及臨床應(yīng)用[M]，上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002.[19]DawsonP,BlomleyM.GadoliniumchelateMRcontrastagents.ClinRadiol,1994,49:439.[20]OudkerkM,VandenHeuvelAG,WielopolskiPA,etal.Hepaticlesions:Detectionwithferumoxide-enhancedT1-weightedMRimaging.Radiology,1997,203:449.[21]WeisslederR.LiverMRimagingwithironoxides:Towardconsensusandclinicalpraitice.Radiology,1994,193:593.[22]ReimerP,RummenyEJ,DaldrupHE,etal.ClinicalresultswithResovist:Aphase2clinicaltrial.Radiology,1995,195:489.[23]NewtonBB,JimenezSA.MechanismofNSF:newevidencechallengingtheprevailingtheory[J].JMagnResonImaging,2009,30(6):1277-1283.[24]ChengZL,ThorekDL,TsourkasA.Gadolinium-conjugateddendrimernanoclustersasatumor-targetedT1magneticresonanceimagingcontrastagent[J].Angew Chem IntEd,2010,49:346-350．[25]FortinMA,PetoralJRM,Sderlindf,etal.Polyethyleneglycol-coveredultra-smallGd2O3nanoparticlesforpositivecontrastat1.5Tmagneticresonanceclinicalscanning[J].Nanotechnology,2007,18(39):395501．[26]BridotJL,FaureAC,LaurentS,etal.Hybridgadoliniumoxidenanoparticles:multimodalcontrastagentsforinvivoimaging[J].JAmChemSoc,2007,129(16):5076-5084．[27]WmdJ，NaikKS，GuthficJA,“a1．Hep“eIesiondetection：tomperlsonofMRIaftertheadministrationofsuperparama日aetloironoxidewithdualphaseCTbyusingaltenmtlve-freeresponsereceiveroperatingcharactedsdcanalysis[J]．Radiology,1999，210(2)：459-66．[28]YangH,ZhuangYM,HuH,etal.Silica-coatedmanganeseoxidenanoparticlesasaplatformfortargetedmagneticresonanceandfluorescenceimagingofcancercells[J].AdvFunctMater,2010,2(11):1733-1741．[29]GarnettMC,KallinteriP.Nanomedicinesandnanotoxicology:somephysiologicalprinciples.OccupMed,2006,56(5):307-311.[30]HYPERLINK