基因診斷工程和基因治療措施

第一節(jié)基因診斷疾病與基因的關(guān)系

基因診斷的意義絕大多數(shù)疾病和基因密切相關(guān)疾病分類：內(nèi)源性基因變異疾病

1.單基因病

2.多基因病獲得性基因病外源性基因（如病毒等）侵入機(jī)體引起的疾病一基因診斷的基本概念和特點(diǎn)二基因診斷的內(nèi)容和基本策略三基因診斷的基本步驟四基因診斷的常用技術(shù)方法五基因診斷的應(yīng)用一基因診斷的基本概念和特點(diǎn)基因診斷的概念

是以DNA和RNA為診斷材料，利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過檢查基因的結(jié)構(gòu)或表型來診斷疾病的方法和過程；其臨床意義在于能檢測DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變動與否，量的多少及表達(dá)情況等，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診或進(jìn)行基因治療的依據(jù)?；蛟\斷的概念界定以下6個方面內(nèi)容：（一）診斷水平基因水平（二）診斷技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用。（三）診斷材料DNA和RNA。（四）診斷內(nèi)容

1、對于內(nèi)源性基因來說：基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)是否異常。

2、對于外源性基因來說：入侵基因的種類，是病毒核酸、細(xì)菌質(zhì)粒還是寄生蟲DNA.

（五）診斷途徑

1、直接檢查基因結(jié)構(gòu)是否存在：DNA點(diǎn)突變、缺失插入、基因重排、染色體畸變、mRNA剪接缺失錯位或結(jié)構(gòu)變化等。

2、檢查基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA：

1）已經(jīng)轉(zhuǎn)錄還是沒有轉(zhuǎn)錄？

2）應(yīng)該轉(zhuǎn)錄還是不應(yīng)該轉(zhuǎn)錄？

3）

轉(zhuǎn)錄正常、過量還是過少？

3、檢查基因表型：正常還是異常，進(jìn)行分析研究。（六）診斷目的

1、

確診相應(yīng)疾病或得出相應(yīng)結(jié)論。

2、

是防治疾病或基因治療的根據(jù)。一基因診斷的基本概念和特點(diǎn)基因診斷的特點(diǎn)1.特異性高2.靈敏度高3.穩(wěn)定性高4.應(yīng)用范圍廣5.臨床應(yīng)用前景好三、基因診斷方法和傳統(tǒng)的疾病診斷方法

表1表型診斷（傳統(tǒng)方法）基因診斷（一）診斷依據(jù)疾病表型變化基因結(jié)構(gòu)異常和表達(dá)異常（二）分類臨床診斷DNA診斷血清學(xué)診斷RNA診斷生化學(xué)診斷（三）特異性表型改變在很多情況下是非特以探測基因?yàn)槟繕?biāo)，只要異性的，往往難以明確診斷，有特異性探針，利用分子延誤病情雜交原理即可診斷，具有很高的特異性。

（四）敏感性探針可用“放標(biāo)”或“非放診斷靈敏度高，標(biāo)本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期診斷因?yàn)楸硇透淖兺霈F(xiàn)較晚，在表型改變之前，基因難以早期診斷結(jié)構(gòu)或表達(dá)已發(fā)生改變，故往往可以早期診斷。

（六）基因診斷范圍廣因?yàn)椋孩偬结樋蔀槿魏蝸碓春头N類，序列可為已知或未知，目標(biāo)可為特定基因或特定基因組合，外源性或內(nèi)源性基因，所以適應(yīng)性強(qiáng)，診斷范圍廣。②被檢查基因是否處于活化狀態(tài)并不重要，故可對分化階段表達(dá)特異性基因及其異常進(jìn)行檢測和診斷，這對腫瘤（如CML）療效及預(yù)后尤為重要。③在感染性疾病的診斷，能檢查正在生長或潛伏病原體，能明確既往感染或現(xiàn)行感染，對不易診斷（如產(chǎn)毒性E.coli）和不能安全培養(yǎng)（如立克次體）進(jìn)行基因診斷，擴(kuò)大了實(shí)驗(yàn)室診斷范圍。基因診斷的內(nèi)容檢測個體的基因序列的特征(多態(tài)性）基因突變分析（堿基插入，缺失，倒位，重復(fù)等）基因表達(dá)產(chǎn)物分析檢測是否存在外源基因基因連鎖分析二基因診斷的內(nèi)容和基本策略基因診斷的基本策略1.對疾病致病基因結(jié)構(gòu)異常的直接診斷2.對疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析3.檢測表型克隆基因1、對疾病致病基因結(jié)構(gòu)異常的直接診斷（1）.基因缺失或插入的診斷（2）.點(diǎn)突變的診斷（3）.STR序列的診斷（4）.致病生物的基因組結(jié)構(gòu)Southern印跡法跨越斷裂點(diǎn)的PCR（又稱裂口PCR，gap-PCR）（1）.基因缺失或插入的診斷Southern印跡法分析基因大片段丟失跨越斷裂點(diǎn)的PCR分析基因缺失（2）.點(diǎn)突變的診斷等位基因特異性寡核苷酸分子雜交

（allelespecificoligonucleotide，ASO）反向點(diǎn)雜交（reversedotblot，RDB）變性高效液相色譜（denaturehighperformanceliquidchromatography，DHPLC）

被測點(diǎn)突變的確切位置及其基因序列已經(jīng)清楚前提條件主要方法特異性寡核苷酸分子雜交檢測點(diǎn)突變反向點(diǎn)雜交（reversedotblot，RDB）

將針對各種突變和正常序列的ASO探針固定在雜交膜上，而將原來在ASO雜交體系中固定在膜上的PCR產(chǎn)物改為液相進(jìn)行雜交，這種方法稱為RDB。是改進(jìn)的ASO技術(shù)。

變性高效液相色譜

利用PCR擴(kuò)增過程的單鏈DNA產(chǎn)物可以隨機(jī)與互補(bǔ)鏈相結(jié)合而形成雙鏈的特性，依據(jù)最終產(chǎn)物中是否會出現(xiàn)異源雙鏈來判斷待測樣品中是否存在點(diǎn)突變變性高效液相色譜檢測基因點(diǎn)突變（3）.STR序列的診斷

可用PCR直接擴(kuò)增技術(shù)來診斷基于STR的DNA片段長度多態(tài)性STR:短串聯(lián)重復(fù)序列PCR技術(shù)直接診斷STR突變（4）.致病生物的基因組結(jié)構(gòu)入侵基因組DNA具有特異的DNA序列，以區(qū)別于別種生物體DNA序列。能把這種特異的DNA序列制成具有特定信號的探針。2、對疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析連鎖分析（linkageanalysis）利用與致病基因相連的某些基因，作為遺傳標(biāo)志，通過鑒定遺傳標(biāo)志的存在而判斷個體是否帶有致病基因優(yōu)點(diǎn)無需更多了解致病基因結(jié)構(gòu)及其分子機(jī)制缺點(diǎn)沒有直接檢測致病基因突變，是間接診斷（1）.連鎖分析的遺傳標(biāo)志特點(diǎn)●不同個體之間存在高度的多態(tài)性

●需要獲得足夠數(shù)量的家系成員樣本

●標(biāo)記基因與致病基因相連鎖標(biāo)記基因A1和A2與致病基因間的連鎖關(guān)系示意圖交換連鎖人群個體核苷酸序列的差異性、稱為DNA的多態(tài)性。由此影響限制酶切部位點(diǎn)而致RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）。RFLP按照孟德爾方式遺傳。故：①可檢測人群中個體間存在的RFLP（限制酶酶譜分析）②遺傳病的基因診斷（連鎖分析）。如果一特定家庭（系）中，某一致病基因與特異性的多態(tài)性片段緊密連鎖（連鎖—是指同一條染色體上相鄰近的基因一起被遺傳），就可以用這種多態(tài)性片段作為“遺傳標(biāo)志”，來判斷家庭成員或胎兒基因組中是否攜帶有致病基因。連鎖遺傳標(biāo)志的類型單核苷酸多態(tài)短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)

目前可用于基因診斷的連鎖遺傳標(biāo)志主要包括兩種形式的DNA多態(tài)性DNA多態(tài)性

DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上形式，對基因功能沒有影響，稱為多態(tài)性(polymorphism)。

DNA序列中大約有1／100～1/200的堿基存在多態(tài)現(xiàn)象。多態(tài)性類型單個核苷酸取代，發(fā)生頻率約為1/500nt；串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)單元長度為10～60bp稱小衛(wèi)星DNA，長度在2～9bp的稱為微位星序列，(CA)n最常見，平均每50kb就發(fā)生一次

在人類基因組中，大約平均200～500bp就可發(fā)生一次變異。這些變異使個體之間廣泛存在著DNA單核苷酸序列的差異單核苷酸變異可檢測的單核苷酸變異的遺傳標(biāo)志限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）

單核苷酸多態(tài)性限制性片段長度的多態(tài)性指DNA序列上發(fā)生一個變異后獲得或丟失了一限制性識別位點(diǎn)，使DNA限制性片段長度發(fā)生變化，在人群中形成兩種或兩種以上的限制性類型利用特定限制性識別位點(diǎn)進(jìn)行基因分析單核苷酸變異EcoRI限制性片段長度的多態(tài)性分析單核苷酸多態(tài)性

（singlenucleotidepolymorphism，SNP）

指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體中的頻率不小于1%SNP可以確定個體的疾病易感性和藥物反應(yīng)性單核苷酸變異短串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列基因組中某種核心序列彼此連接重復(fù)排列而成的特殊序列短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat，STR）在串聯(lián)重復(fù)序列中的一種2～4bp的重復(fù)單位短串聯(lián)重復(fù)序列●在人類基因組中分布廣泛，總數(shù)大約有5～10萬個●個體之間的STR都是互不相同的●能夠穩(wěn)定地遺傳短串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（2）.連鎖分析的主要方法RFLP連鎖分析基于STR的微衛(wèi)星分析基于SNP的單倍型分析3、檢測表型克隆基因三基因診斷的基本步驟1.獲得待檢樣品2.制備和標(biāo)記探針3.基因檢測分析四基因診斷的常用技術(shù)方法（一）.核酸分子雜交技術(shù)等位基因特異寡核苷酸探針雜交ASO探針法ACTGASO探針正常病人探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子四基因診斷的常用技術(shù)方法（二）.限制性內(nèi)切酶酶譜分析法+—四基因診斷的常用技術(shù)方法（三）.DNA限制性片段長度多態(tài)性

RFLP分析四基因診斷的常用技術(shù)方法（四）.PCR技術(shù)

PCR-SSCP:DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性解鏈DNA原理過程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物↓變性↓單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

.

PCR-SSCP五基因診斷的應(yīng)用（一）.遺傳性疾病的基因診斷1、輔助遺傳病的臨床診斷我國前能開展的基因診斷

單基因遺傳病的基因診斷以淘汰重型患兒為目的的產(chǎn)前診斷

2、疾病易感性及患病風(fēng)險預(yù)測（1）.遺傳病患病風(fēng)險分析（2）.其他疾病易感性預(yù)測性診斷1.遺傳病患病風(fēng)險分析產(chǎn)前診斷植入前遺傳學(xué)診斷遺傳篩查產(chǎn)前診斷

分析胎兒的某些特定基因以診斷人類染色體病和單基因遺傳病

指對配子或移入宮腔之前的胚胎進(jìn)行快速的遺傳學(xué)分析，篩選出健康配子或胚胎，以避免異常妊娠的一項(xiàng)技術(shù)植入前遺傳學(xué)診斷遺傳篩查

指針對特定人群的系統(tǒng)檢查，以期獲得被檢測群體中的個體是否擁有某一特定疾病的基因型，從而為被檢對象或其子女提供疾病易感性、患病風(fēng)險的相關(guān)信息2.其他疾病易感性預(yù)測性診斷腫瘤與癌基因抑癌基因

在一些有明顯遺傳傾向的腫瘤中，這二類基因的突變與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系例：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與RB基因

Li-Fraumeni綜合征與p53基因乳腺癌與BRCA-1基因?qū)@些基因的突變分析對于疾病診斷和預(yù)測腫瘤發(fā)生風(fēng)險有一定的參考價值（一）血紅蛋白病血紅蛋白病是由于血紅蛋白合成異常所致的遺傳性血液病。習(xí)慣上分為異常血紅蛋白病和地中海貧血２類。

1.異常血紅蛋白病是珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)的改變變導(dǎo)致主要功能部位氨基酸的置換，影響Hb的溶解度、穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。分子基礎(chǔ)：單堿基替代，缺失、插入……

２.地中海貧血（α地中海貧血和β地中海貧血）是珠蛋白合成速率降低，導(dǎo)致鏈和非鏈合成的不平衡→多余的珠蛋白鏈沉積在Rbc膜上→改變了膜的通透性和硬度→導(dǎo)致溶血性貧血。4.診斷要求HbPunjabα地中海貧血（α珠蛋白合成↓）β地中海貧血（β珠蛋白合成↓）占我國新疆異常Hb病55.6%（1）產(chǎn)前診斷為主要目的。每一民族或群體有特突變類型譜中國人主要突變類型有6種分子基礎(chǔ)Hbβ鏈121密碼單個堿基替代：GAA（Glu)→CAA（Gln）→改變了EcoRI一個識別位點(diǎn)大多數(shù)是α珠蛋白基因缺失所致。點(diǎn)突變、缺失或插入往往不涉及限制酶識別位點(diǎn)。DNA診斷：PCR擴(kuò)增（β珠蛋白第3個外顯子和基因3′端DNA序列、全長144bp）EcoRI酶切電泳分析。（3）液體分子雜交C1限制酶譜分析，或PCR擴(kuò)增電泳分析PCR/ASO探針法（主要方法）結(jié)果正常對照40/104bp兩個片段HbPuNJob144bp,40/104bp兩種類型雜合子（同理擴(kuò)增β珠蛋白DNA片段MnlI酶譜分析診斷HbE（β26Glu→Lys))正常對照有正常雜交信號（C1）酶切片段不缺（C2）PCR產(chǎn)物有（C3）α地貧與正常結(jié)果反之。PCR/RFLP連鎖分析法RNA診斷：異常Hb病人mRNA的RT/PCR產(chǎn)物測序知編碼區(qū)堿基變化—推導(dǎo)相應(yīng)氨基酸變化。RT-PCR介導(dǎo)的α珠蛋白mRNA定量↓。①PCR介導(dǎo)的mRNA定量法。②mRNA的剪切缺陷檢測（二）杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）和貝克營養(yǎng)不良癥（BMD）1.DMD和BMD是常見的性連鎖隱性遺傳病，

2.主要特征是進(jìn)行性肌萎縮和腸肌假性肥大，XP21.21—21.3區(qū)抗肌萎縮蛋白基因突變形式不同。

DMD多在5歲發(fā)病，在20歲左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其發(fā)病率為活產(chǎn)男嬰的1/3500。

BMD癥狀較DMD為輕，壽命較長，并有生育能力，發(fā)病率為1/30000。

3.分子基礎(chǔ)：抗肌萎縮蛋白基因內(nèi)（1）DNA片段缺失（60%的病例→導(dǎo)致閱讀框移碼→移碼實(shí)變→致DMD，整碼缺失→BMD）。（2）部分重復(fù)（病例的5%）（3）缺失或重復(fù)的2個熱點(diǎn)區(qū)①該基因5’端處②45~55外顯子范圍內(nèi)。4.DMD、DNA診斷因DMD（及BMD）大多數(shù)為基因缺失所致，該病DNA診斷主要是抗肌萎蛋白基因缺失的檢測。診斷技術(shù)：（1）基因組探針法用XP21區(qū)分離得到的不同探針如（P20）來接進(jìn)行相應(yīng)內(nèi)切酶酶譜分析、檢出率取決于探針數(shù)和酶切位點(diǎn)數(shù)目。（2）cDNA探針法抗肌萎縮蛋白基因系列cDNA探針分析患者基因缺失、外顯子拼接改變和基因內(nèi)部分重復(fù)。（3）多重PCR法如有人設(shè)計多對引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增該基因的9個易發(fā)缺失“熱點(diǎn)區(qū)”DNA片段，可檢出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多態(tài)性分析法基因內(nèi)及其旁側(cè)探針進(jìn)行RFLP連鎖分析或CA多態(tài)性分析適用于非缺失型DMD。5.DMD、RNA診斷：診斷技術(shù)RT—PCR擴(kuò)增該基因外顯子（全長2.4MB、外顯子起來全長c14kb、用多對引物）可檢出：外顯子拼接異常。聯(lián)用測序：可定位基因缺失的起始和終止。（三）苯酮尿癥（PKU）

1、苯尿癥是一種常見的隱性患傳性氨基酸代謝病。

2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→兒茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素（2）患兒出生后須及早得到低phe飲食治療，否則發(fā)生不可逆大腦損害和嚴(yán)重智力發(fā)育障礙。

3、分子基礎(chǔ)：（1）迄今約3/4的導(dǎo)致中國人經(jīng)典型重PKU的突基因已被查清，它們分屬11種基因PAH基因點(diǎn)突變。體外研究表明，這些突變導(dǎo)致PAH活力↓或喪失。（2）PAH第11外顯子的第399密碼GTA（val）→GTT（val）中性突變：①不改變?nèi)魏蜗拗泼缸R別位點(diǎn)，故又稱“序列多態(tài)性”。②這一“序列多態(tài)性”在PKU患者和正常人中存在著連鎖不平衡性，故可作為一種“遺傳標(biāo)記”應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。苯丙氨酸羥化酶↓（肝、PAH）4、DNA診斷：①PCR/ASO探針法。若待診斷的PKU家系的基因突變類型尚屬“未知”或無RFLP信息。②PCR/SSCP—直接則序法→不定期出導(dǎo)PKU的點(diǎn)突變。5、序列多態(tài)性連鎖分析前提是該家系存在述第399密碼子序列多態(tài)性用于產(chǎn)前診斷：（不知基因?qū)嵶冾愋停矡oRFLP信息。）病案—某孕婦曾生育一例PKU患者，現(xiàn)妊娠第二胎8周，要求對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。診斷：（1）PAH基因的RFLP分析：該家庭除ECORI外，其它酶切點(diǎn)都不具有雜合性，而丈夫、患兒、孕婦、胎兒雙均為ECORI11/17kb片段的雜合子，因此胎兒可能正常，可能為PKU患者。據(jù)RFLP分析無法對胎兒作出產(chǎn)前診斷（為什么？缺乏基因連鎖分析先決條件。（2）序列多態(tài)性：PCR/ASO探針DNA片段點(diǎn)雜交法。①PCR擴(kuò)增父親、孕婦/患兒、胎兒PAH基因片段。②合成ASO（相應(yīng)于第399密碼子中性實(shí)變序列的一對等位基因的特異ASO探針。③雜交：說明：①患兒擴(kuò)增DNA片段與正常/中性突變ASO探針雜交;②父親;③胎兒擴(kuò)增a、患兒的1個PKU，基因與密碼子399A→T中性突變相偶（連鎖），這個PKU基因來自母方。a.孕婦。b、胎兒沒有這一中性實(shí)變，可以排除胎兒為PKLL患者，結(jié)合ECLRI位點(diǎn)RFLP資料，可產(chǎn)和的診斷胎兒完全正常。c、胎兒出生后基因分析和隨方證實(shí)診斷正確。DNA片段中能與正常的ASO探針雜交。四、血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，由于正常凝血過程中血漿凝血的活力有缺陷所致?；颊叱Ｒ虺鲅恢够蚶^發(fā)病而夭折，治療主要靠替代療法，輸入缺乏的血漿因子。重型血友病甲和乙的男性發(fā)病率為1/5000~1/50000。為甲型血友病和乙型血友病。

主要特征：①是一組X連鎖遺傳凝血缺陷疾病。②缺乏Xq遠(yuǎn)端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突變具極為異質(zhì)性，與β地貧不同。（因子占X染色體全長0,1%，共186kb包括26個外顯子）不存在存族和群體特異性，幾乎每一種不同的甲型血友病家系都具有自已獨(dú)特的突變類型。（所以該病基因診斷不宜用PCR/ASO探針直接檢測點(diǎn)突變，而主要依賴RFLP連鎖分析）①也是X連鎖遺傳的凝血缺陷疾病。②約1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替代療法過程中會產(chǎn)生FIX的抑制物）。③在非缺失（FIX基因）型中，已發(fā)現(xiàn)398種不同的基因突變。（FIX基因定位在Xq26→q27，全長34kb包括8個外顯子）。①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鑒定了FIX基因的5個限制者多態(tài)性位點(diǎn)，故可用RFLP連鎖分析進(jìn)行產(chǎn)前診斷和攜帶者檢測。②病倒：乙型血友家系分析FIX基因發(fā)現(xiàn)某患者缺失該基因5kbDNA序列（第2~3外顯子+第2內(nèi)含子全部+部分第1，第3內(nèi)含子）a、對該家系一例乙型血友病變高危妊娠產(chǎn)前基因診斷，診斷胎兒為男性乙型血友病患者。b、對該孕婦第二胎產(chǎn)前診斷為女性乙型血友病基因攜帶者。（上海醫(yī)遺傳所淅江乙型血友病家系）4、診斷情況（報道）：①應(yīng)用克隆化FⅧcDNA與VIII基因連鎖DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁側(cè)的限制酶酶切位點(diǎn)多態(tài)性，并采用PCR/BCLI或XbaIRFLP連鎖分析法進(jìn)行了甲型血友病的產(chǎn)前診斷和攜帶者檢測。②用PCR/SSCP法檢查了FVIII內(nèi)含子18處BCLI的多態(tài)性。（終止妊娠對胎兒作凝血子測定和DNA分析、證實(shí)產(chǎn)前診斷正確。）（二）、腫瘤的基因診斷惡性腫瘤是由于多階段、多步驟、積累性的DNA突變和損傷發(fā)生于調(diào)控細(xì)胞分化生長功能的基因（激活原癌基因、抑制抑癌基因、妨礙DNA修復(fù)校對）上造成的。DNA突變和損傷可是遺傳來的，也可以后天被誘變的。DNA突變和損傷包括基因的點(diǎn)突變、基因缺失、擴(kuò)增、重排等。（三）.傳染病的基因診斷

針對病原體自身特異性核酸（DNA或RNA）序列進(jìn)行的診斷分子雜交基因擴(kuò)增方法優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用范圍廣泛簡便快速、成本低特異、敏感、便于定量（四）PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用DNA指紋分析在法醫(yī)學(xué)上應(yīng)用于個體識別和親子鑒定原理：人類基因組非編碼區(qū)存在VNTR,不同個體間VNTR的串聯(lián)數(shù)目不一樣（長度不同）以VNTR核心序列為探針與同一限制性內(nèi)切酶酶切的人類DNA進(jìn)行Southern雜交后，同一個體不同組織來源的DNA譜帶完全一樣，而不同個體（除非同卵雙生）的譜帶都不相同。就像人的指紋一樣具有高度個體特異性，故稱這種Southern雜交圖為DNA指紋。DNA指紋概念——在人體基因組DNA中存在高度可變的小衛(wèi)星區(qū)域，在同一酶解物的Southern印跡圖上同一個體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個體特異性一樣，這種southern印跡圖被稱為DNA指紋。.DNA指紋按孟德爾方式遺傳。

序列長度多態(tài)性（或數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)，variablenumbertendomrepeats,VNTR）

重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列。散在地分布于染色體上，以插入/缺失方式形成多態(tài)。如圖：VNTR兩側(cè)的酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。VNTR酶切，電泳后的Southern雜交檢測結(jié)果大小PCR-VNTR檢測

（占主導(dǎo)地位）

DNA指紋進(jìn)行親子鑒定遺傳學(xué)基礎(chǔ)是DNA的多態(tài)性DNA指紋圖譜分析第二節(jié)基因治療第一節(jié)基因治療的概念和分類

（一）基因治療的概念（genetherapy）

通過一定方式將人正?；蛞吧停╳ildtype）基因或有治療作用的DNA片段導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以矯正或置換致病基因的治療方法。

（二）基因治療的分類1.依據(jù)靶細(xì)胞分類生殖細(xì)胞基因治療（限于動物）體細(xì)胞基因治療2.依據(jù)基因治療實(shí)施路線分類間接基因治療（回體法）直接體內(nèi)治療（體內(nèi)法）3.依據(jù)轉(zhuǎn)移基因在靶細(xì)胞染色體上的整合位點(diǎn)同源重組法（一般不用）隨機(jī)整合法二基因治療的動物模型

以轉(zhuǎn)基因動物和基因剔除動物為模型

三基因治療的總體策略

三、基因治療的策略

基因替代和基因矯正治療（致病基因的原位置換）

用正常的基因置換染色體上的致病基因。但目前基因定向同源重組的技術(shù)還不能達(dá)到理想的效果。三、基因治療的策略

2.代償性基因治療

通過對有代償功能的基因的正調(diào)控，來代償功能異常的基因。

3.基因補(bǔ)償性治療（基因的異位替代）

在體外將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的宿主細(xì)胞，只要求治療基因能夠替代致病基因在體內(nèi)表達(dá)出功能正常的蛋白質(zhì)。是目前基因治療的主要策略。

4.基因失活性治療（直接抑制有害基因的表達(dá)）已知某一疾病基因，可向患者體內(nèi)導(dǎo)入某一抑制該基因的基因或有抑制該基因作用的核酸?；蚪柚锛夹g(shù)（反義RNA、siRNA、核酶等）抑制或封閉該疾病基因的mRNA的功能。三、基因治療的策略

5.調(diào)控性基因治療

通過導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因以治療基因表達(dá)異常的疾病。

6.應(yīng)用“自殺基因”的基因治療攜帶自殺基因（如HSV-tk）的受體細(xì)胞本身被殺死。如將自身基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，該基因產(chǎn)物即可催化無毒前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素，從而殺死腫瘤細(xì)胞，正常細(xì)胞不含此自殺基因，不受影響。三、基因治療的策略

將抗體或細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以激活體內(nèi)免疫細(xì)胞的活力。

8.化療保護(hù)性基因治療向正常細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入單項(xiàng)或多項(xiàng)細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，使得正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力大大提高。三、基因治療的策略

7.免疫修飾性基因治療

（增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的基因治療）

將抗體或細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以激活體內(nèi)免疫細(xì)胞的活力。

10.生殖細(xì)胞基因治療

三、基因治療的策略

9.特異性細(xì)胞殺傷性基因治療四、基因治療的一般程序

1.治療基因的選擇和獲取

細(xì)胞內(nèi)的基因在理論上均可用于基因治療?？捎嗅槍π缘剡M(jìn)行選擇。2.基因治療靶細(xì)胞的選擇

體細(xì)胞

包括：病變組織細(xì)胞正常的免疫功能細(xì)胞

1）（hematopoieticstemcells）骨髓中具有高度自我更新能力的、能永久重建造血的細(xì)胞，同時它能進(jìn)一步分化為其他血細(xì)胞，并能保持基因組DNA的穩(wěn)定

造血干細(xì)胞2）肌細(xì)胞胞內(nèi)的溶酶體和DNA酶含量也很低，質(zhì)粒DNA以環(huán)狀形式在胞漿中存在不整合入基因組DNA，能在肌細(xì)胞內(nèi)較長時間保留成功用于基因治療的靶細(xì)胞

靶細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)造血干細(xì)胞自我更新能力和分化能力。最有前途的靶細(xì)胞之一。骨髓中含量低，難以獲得足夠的量皮膚成纖維細(xì)胞來源廣，易擴(kuò)增培養(yǎng)，易于移植?？梢苑€(wěn)定表達(dá)一段時間肌細(xì)胞易于吸收，肌細(xì)胞內(nèi)的溶酶體和DNA酶含量很低。適合DNA疫苗治療。

選擇基因治療靶細(xì)胞的參照因素發(fā)病的器官及位置靶細(xì)胞應(yīng)容易取出和移植靶細(xì)胞容易在體外培養(yǎng)對靶細(xì)胞容易實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞應(yīng)具有較長的壽命三、基因治療中基因?qū)氲姆椒?/p>

(一)非病毒導(dǎo)入法物理方法：顯微注射法，電擊法，基因槍法化學(xué)方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等●

優(yōu)點(diǎn)不會整合入靶細(xì)胞的基因組中●

缺點(diǎn)易在靶細(xì)胞中降解1.直接注射法

將含有裸DNA（質(zhì)粒）的溶液直接注射入肌肉組織●優(yōu)點(diǎn)可持續(xù)表達(dá)幾個月至一年●缺點(diǎn)僅限于在肌肉組織需要注射大量的DNA

轉(zhuǎn)入效率低2.電穿孔法

用高壓脈沖電場在細(xì)胞膜上打孔將DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素

電脈沖強(qiáng)度持續(xù)時間3.脂質(zhì)體法(liposome）

脂質(zhì)體與DNA形成復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞

4.陽離子多聚體

陽離子聚胺與陰離子DNA形成復(fù)合物，與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞

（二）病毒載體導(dǎo)入法

●病毒的特點(diǎn)靶細(xì)胞定向感染性宿主細(xì)胞寄生性

●野生型病毒改造的原則保留感染性去除致病性使病毒缺失其自身復(fù)制所必需的基因，而替換成治療性基因及基因的調(diào)控元件，使之成為表達(dá)性載體。

基因治療中的病毒載體

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體2、腺病毒載體3、主要病毒載體的特點(diǎn)比較4、存在的主要缺點(diǎn)1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retrovirus）

（1）.基因組2.特點(diǎn)

●來源莫羅尼氏鼠白血病病毒（MoMuLV)●感染范圍鼠、人和其它動物細(xì)胞●感染方式通過外膜蛋白與靶細(xì)胞表面的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合而感染進(jìn)入細(xì)胞●專一性

取決于病毒顆粒膜糖蛋白Env和靶細(xì)胞膜表面的受體相互作用?？梢詫⒉《就饽ぬ堑鞍走M(jìn)行各種不同的修飾，以改變其專一性。分類：①單嗜性（ecotropic）病毒：僅能感染小鼠細(xì)胞②雙嗜性（amphotropic）病毒：能感染小鼠和其他動物細(xì)胞③兼嗜性（dualtropic）病毒：能感染多種不同種屬的動物細(xì)胞。

●逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因治療的流程將治療基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中→篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞→轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)→從上清中獲得重組病毒顆粒和純化→感染靶細(xì)胞。二、腺病毒載體

DNA病毒。根據(jù)其凝血特性分為A-F6個亞類，其中C亞類的2型和5型腺病毒（Ad2和Ad5）在人體內(nèi)基本上不致病，故可作為基因治療用載體?！駜?yōu)點(diǎn)

基因轉(zhuǎn)移效率較高治療基因瞬時水平表達(dá)高三、主要病毒載體的特點(diǎn)比較

逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)慢病毒(HIV、FIV等)腺病毒(Ad)腺相關(guān)病毒(AAV)單純皰疹病毒(HSV)基因組大小(kb)8～119.2～9.7354.6152核酸類型RNARNADNADNADNA外源基因容量約10kb約10kb7～8kb約4kb可達(dá)30kb重組病毒滴度較高較高非常高高相對低靶細(xì)胞狀態(tài)分裂期細(xì)胞，表面須有特殊受體分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞分裂期細(xì)胞及非分裂期細(xì)胞，嗜神經(jīng)性基因整合隨機(jī)整合隨機(jī)整合不整合定點(diǎn)整合不整合外源基因表達(dá)情況瞬時表達(dá)/穩(wěn)定表達(dá)瞬時表達(dá)/穩(wěn)定表達(dá)瞬時表達(dá)穩(wěn)定