蛹蟲草子實體中天然色素的提取工藝

長春工業(yè)大學本科畢業(yè)論文前言蛹蟲草最早源于中國，俗稱北冬蟲夏草或北蟲草，由于其藥用價值與冬蟲夏草極其相似，故藥典中記為“北冬蟲夏草”。味甘、性平，具有益肺補腎，止血化痰的功效。近些年的研究表明：蛹蟲草與冬蟲夏草極其相似，無毒副作用，可做為冬蟲夏草的良好代用品。其在治療老年癡呆，清除人體自由基，降血脂，保護肝腎及呼吸系統(tǒng)，調節(jié)內分泌與免疫系統(tǒng)，抗腫瘤、抗疲勞、抗病源微生物，鎮(zhèn)靜抗驚厥作用等方面有極佳的功效。蛹蟲草天然色素作為蛹蟲草子實體中的生理活性物質之一，也是研究的重點。所以，隨著對蛹蟲草子實體中天然色素研究的不斷深入，利用蛹蟲草子實體中天然色素開發(fā)的保健品，功能性食品添加劑和藥品的市場前景為人研究者們所看好。為了研究出有利于人們身體健康的、經濟效益高的蛹蟲草子實體中天然色類的深加工產品，就需要我們廣大的食品科學家、生物學家和醫(yī)學家們的共同努力，從而帶動整個研究的快速發(fā)展。因此，本實驗開展對蛹蟲草子實體中天然色素提取工藝的研究和優(yōu)化，為工業(yè)化規(guī)模性生產蛹蟲草子實體天然色素提供理論依據(jù)。文獻綜述2.1蛹蟲草子實體2.1.1生長條件蛹蟲草子實體是蛹蟲草生殖細胞“孢子”（相當于植物的種子）隨風飄散粘上某些昆蟲的蛹后，萌發(fā)菌絲并侵入蛹體內吸取養(yǎng)分，而后從蛹體上長出的金黃色、或橘黃色、或橘紅色的棍棒狀物體，是產生生殖細胞“孢子”的生殖體（相當于植物的果實體）。圖2.1人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實體圖2.2蛹蟲草菌絲體生長史蛹蟲草是一類復型真菌，在生活史中有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。蛹蟲草的菌絲是一種子囊菌，當子實體成熟后可以形成子囊孢子，孢子散發(fā)后隨風傳播。如果孢子落在適宜的昆蟲蛹（蟲）體上，特別是幼蟲的蟲體上后，便開始萌發(fā)形成菌絲體[1]。菌絲體以昆蟲蛹體或蟲體的體內組織和器官作為其生長發(fā)育的物質和能量來源，很快布滿整個昆蟲蛹體或蟲體的內部，最后將蛹體或蟲體內部各種組織和器官完全分解。自此以后，菌絲體由營養(yǎng)生長開始轉為生殖生長，菌絲體扭結，并從蟲體空殼的頭部、胸部、近尾部等處伸出，形成金黃色、橘黃色或橘紅色的、頂部略膨大的棒狀子實體。在子實體的頂端，著生許多表面呈乳頭狀突起的子囊殼，每個子囊殼內產生許多子囊孢子，當子囊孢子成熟后放射出來，又開始下一輪生活史。生長地域蛹蟲草寄主的專一性不強，可寄生于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲的幼蟲、成蟲和蛹，并且大多數(shù)寄生于蛹。其寄主昆蟲共有3目11科19種。野生蛹蟲草是一種世界性分布的廣布種，其地理分布區(qū)域遍及全世界。在我國，野生蛹蟲草主要分布在吉林，遼寧、河北、陜西、安徽、廣西、云南、廣東、四川、貴州、湖北、湖南、山西、山東、江蘇，河南等十幾個省區(qū)[2]。主要表現(xiàn)出以下分布規(guī)律：多生長于春夏季節(jié)的4～7月份，或秋冬季節(jié)的8～11月份；海拔高度一般在100～2000左右；年均氣溫為2～12℃，最高氣溫36℃，最低氣溫-36℃，在蛹蟲草大量產生的4～11月份，氣溫較高，平均氣溫為9～28℃；蛹蟲草產區(qū)多屬溫帶濕潤氣候，年均降水量在650毫米以上，空氣相對濕度為60～95%，土壤濕度為20～65%；野生蛹蟲草多產生在針闊混交林地上，土壤多為棕壤土、紫紅壤土等腐殖質土壤，一般土壤腐殖層3～9厘米的林地中較多[3]。2.1.2功能作用蛹蟲草含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、蛋白質、超氧化物歧化酶（SOD）、麥角甾醇、氨基酸、維生素及多種微量元素，與冬蟲夏草的化學成分基本相同[4]。另外還包含蟲草素在內的腺苷、尿苷、尿嘧啶、腺嘌呤等物質。蟲草素1951年，加拿大的Cunningh等觀察到被蛹蟲草寄生的昆蟲組織不易腐爛，隨后從中分離到一種腺苷類活性物質，命名為蟲草素(Cordycepin)，并確定其結構式為3’-脫氧腺苷(3’-Deoxyadenosine)，蟲草素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗菌素。蟲草素又稱蟲草菌素、蛹蟲草菌素、3’-脫氧腺苷。在已報道的400多種蟲草中，蛹蟲草是唯一能大量產生蟲草素的蟲草。分子生物學和現(xiàn)代醫(yī)學的研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素具有多方面作用[5]：免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗真菌；增加脾臟重量、加快肝臟核酸和蛋白質更新速度，抗缺氧、增加心肌營養(yǎng)血流量及降低血清膽固醇和B酯蛋白，刺激糖酵解導致ATP合成增加，增強肝臟功能和肌肉中CPK的活性，對由于激素失調引起的性功能損傷有修復作用，能明顯增加冠脈血流量，降低冠脈、腦及外圍血管阻力。丁向萍[6]等的研究報告《蟲草素誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡及對端粒酶活性影響的研究》中指出，蟲草素有抗腫瘤的作用。蟲草酸蟲草酸(Cordycepicacid)是冬蟲夏草主要活性成分之一，又名甘露醇(Mannitol)，化學分子式C6H14O6，為1,3,4,5—四羥基環(huán)已酸。施英[7]等在《蛹蟲草藥理作用研究進展》中提到，蟲草酸能抑制各種病菌的成長，可預防與治療腦血栓、腦出血、心肌梗塞、長期衰竭；蟲草酸含量的高低是衡量蟲草質量的主要標準之一，一般認為蟲草酸含量高的蟲草的藥用價值高。黎穎[8]在《甘露醇的性質、生產與發(fā)展建議》中提到：甘露醇（蟲草酸）由于能部分吸收、并發(fā)生代謝，是一種較強的自由基清除劑，以及其滲透性脫水和利尿的作用。蟲草多糖蟲草多糖是一類高分子復合物，在蛹蟲草中含量為4～10%，是蛹蟲草中含量最高的主要藥理活性物質。它的抗癌活性和免疫活性已引起人們的極大興趣。從1977年開始，日本和中國的科研人員開始對蟲草多糖開展研究，已從天然冬蟲夏草以及人工培育的蟲草真菌中分別分離純化出了多種多糖組份，并對其理化性質和藥理活性進行了詳細研究。大量研究表明，蟲草多糖有著多種生物活性功能，被醫(yī)學界和藥物學界認為是當前世界上非常好的免疫促進劑之一[9]，具有廣泛的藥理作用：可活化巨噬細胞刺激抗體產生，提高人體免疫能力，改善呼吸系統(tǒng)，可使腎上腺重量、血漿皮質醇、醛固酮及腎上腺內膽固醇含量增加，有促進腎上腺的作用，抑制腫瘤生長，并具有抗腫瘤[10]、抗輻射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、潤肺和延緩衰老等藥理作用，此外,蟲草多糖還能抗心律失常，抗心肌缺血，擴張外周血管，降壓，降血脂，抑制血小板聚集。李連德[11]等在《蟲草多糖研究進展（綜述）》中總結道：多糖是存在于自然界的醛糖和酮糖通過糖苷鍵連在一起的多聚物，是一切有生命的有機體必不可少的成分，同維持生物機能密切相關。多糖作為藥物始于1943年，并廣泛作為廣譜免疫抑制劑。多糖是非特異性的免疫調節(jié)劑（生物效應調節(jié)劑BRM），它主要影響網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（RES）、巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞以及RNA、DNA、蛋白質的合成、CAMP（環(huán)化腺苷-磷酸）的含量，抗體的生成、補體的形成以及干擾素的誘生，并具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性。超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD)，別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡稱SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質[12]。對人體不斷地補充SOD具有抗衰老的特殊效果。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敵，是機體內氧自由基的頭號殺手，是生命健康之本。趙勇[13]在《超氧化物歧化酶（SOD）的應用研究進展》中驗證：超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在與一切生物機體內，通過催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應、減輕或消除超氧陰離子自由基對機體的損害。超氧化物歧化酶還可以被應用在醫(yī)藥、食品、農業(yè)和化妝品等領域[14]。麥角甾醇麥角甾醇是生產維生素D2的前體，也是生產激素類藥物的中間體，可用來生產可的松、黃體酮，有維生素D2的作用。鄧玉清[15]等人在《微生物麥角甾醇的研究進展》中印證了：角固醇是微生物細胞膜的重要組成部份，對確保細胞膜的完整性，膜結合酶的活性，膜的流動性，細胞活力以及細胞物質運輸?shù)绕鹬匾饔?。高虹[16]等人在《巴西菇麥角甾醇抗腫瘤活性及作用機理初探》結果表明：巴西菇子實體中提取的麥角甾醇在劑量10mg/kg·d、50mg/kg·d和100mg/kg·d時的瘤重抑制率分別為62.75%、77.61%和79.18%，說明麥角甾醇有較強的抑瘤活性。其他成分除上述成分外，還包含多種微量元素以及蟲草素在內的腺苷、尿苷、尿嘧啶、腺嘌呤等物質。腺苷是一種遍布人體細胞的內源性核苷，可直接進入心肌經磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時還參與擴張冠脈血管，增加血流量。腺苷對心血管系統(tǒng)和肌體的許多其它系統(tǒng)及組織均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體。蛹蟲草富含硒，硒被稱為微量元素中的抗癌之王，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—PX)的必需組分，GSH-PX可引起人體不斷產生可致癌自由基的破壞。此外，蛹蟲草子實體中含有的氨基酸、維生素對蛹蟲草的功效開發(fā)也有一定作用。2.1.3藥用價值提高免疫力蛹蟲草子實體中含有的蟲草多糖是提高免疫力的最主要的原因。蟲草的82.2%為不飽和脂肪酸，此外，尚含有維生素B12、麥角脂醇、六碳糖醇、多種生物堿等，具有調節(jié)免疫系統(tǒng)功能，提高細胞能量、抗疲勞的功效。徐廷萬[17]等實驗得出：人工蛹蟲草胞外多糖可增強免疫功能被抑制的非特異性免疫功能和體液免疫功能，還有抗疲勞作用。戴瑛[18]等實驗得出：蛹蟲草提取物可調節(jié)小鼠機體組織的免疫功能，可以緩解由于內毒素或類似物質造成的肺部炎癥，具有一定的肺保護作用。劉海燕、魏本征[19]等也通過實驗表明：柞蠶蛹蟲草對小鼠機體的非特異性免疫功能有明顯的增強作用?？拱┳饔糜枷x草有良好的抗癌作用，而發(fā)揮最大功效的就是蛹蟲草子實體中的蟲草素。。孫艷等通過對荷肝癌小鼠的實驗得出，人工蛹蟲草子實體具有抑癌作用，除直接作用外，還可使宿主特異性免疫功能增強而獲得明顯的免疫保護效應。孫科峰[20]等實驗表明：蛹蟲草子實體可明顯延長S180腹水型小鼠的生存率,對S180實體瘤小鼠的腫塊生長有一定的抑制作用;對S180荷瘤小鼠的腫瘤免疫活性因子TNF-β和IL-2有明顯的促進作用。湯新強[21]等將人工蛹蟲草胞外多糖與治療劑量的卡鉑合用，可增強卡鉑的抗腫瘤作用。抑菌、抗炎作用蟲草素對葡萄球菌、鏈球菌、鼻疽桿菌、炭疽桿菌、豬出血性敗血癥桿菌等均有抑制作用。蛹蟲草煎劑對須瘡癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣小芽孢癬菌、羊毛狀小芽孢癬菌等真菌及鳥結核桿菌、枯草桿菌、鼻疽桿菌等結核桿菌也均有抑制作用。賓文等[22]實驗表明，人工培養(yǎng)蛹蟲草多糖具有抗炎作用，對細胞免疫沒有明顯的影響。鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用陳桂寶[23]等研究表明，蛹蟲草有明顯的鎮(zhèn)靜、耐缺氧、抗炎等作用，對異丙腎上腺素誘發(fā)小鼠心肌耗氧量增加也有明顯的保護作用。陳敬民[24]等發(fā)現(xiàn)蛹蟲草能明顯減少小鼠的自主活動,拮抗戊四氮所致的小鼠驚厥和一定程度協(xié)同戊巴比妥鈉誘發(fā)小鼠睡眠,表明蛹蟲草具有鎮(zhèn)靜催眠作用?？顾ダ献饔媚挲g的增長和某些體外因素會造成機體和皮膚組織自由基產生超過機體正常清除自由基的的能力，從而使皮膚組織造成傷害，導致衰老。由于SOD能夠清除自由基，因而可以延緩衰老。人之所以會衰老，老化跡象一點一滴出觀，如色素沉淀、體力衰退、是因為體內產生氧化作用，所謂“氧化作用”就類似于生銹，抗氧化劑的補充有助于降低氧化的速度，減慢衰老的腳步。王琦[25]等實驗結果表明，蛹蟲草能明顯降低老年大鼠體內的過氧化脂質（LPO）含量和自由基水平，進而保護細胞免受O2-損害，延緩器官和整個機體的衰老。張桂英等也做了這方面的實驗，結論是柞蠶蛹蟲草具有提高老齡大鼠超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和明顯降低LPO含量的作用。降血脂趙鵬[26]等用不同劑量的蛹蟲草菌絲體粉對大鼠的灌胃實驗得出：蛹蟲草菌絲體具有降低血脂的作用。其他作用除以上功效外，蛹蟲草子實體還有其他功能，例如：抗病毒、抗菌、明顯抑制腫瘤生長、干擾人體RNA及DNA合成，預防治療腦血栓、腦溢血、腎功能衰竭，利尿，同時還有抑制血小板積聚防止血栓形成，消除面斑，抗衰防皺的功效。2.2天然色素色素可分為天然色素和合成色素兩大類。而來源于天然植物的根、莖、葉、花、果實和動物、微生物等的色素，稱為天然色素。由于天然色素對人體無毒無害，營養(yǎng)價值高，且有些具有一定的生物活性，而從添加量上看食用色素在食品中占的比例很小，一般為產品，飲料、酒類、糕點、糖果、醫(yī)藥等的千分之幾、萬分之幾甚至是十萬分之幾。2.2.1天然色素的種類天然色素按來源和性質，可分為植物、動物、微生物和礦物色素。礦物色素大多對人體有害，現(xiàn)已不再用于食品著色，動物、微生物色素的應用也較少。天然植物色素可根據(jù)化學結構，形態(tài)來源和溶解性進行分類，最常用的方法是按照化學結構來分類。多酚類色素多酚類色素主要包括：茶黃色素、多穗柯棕、兒茶黑色素、金櫻子棕等。類胡蘿卜素類類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，屬于化合物。普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類和細菌中的黃色、橙紅色或紅色的色素，主要是β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素，因此而得名。不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶劑，亦稱脂色素。主要包括：番茄色素（番茄紅素）、天然胡蘿卜素、混合類胡蘿卜素、玉米黃、胭脂俗橙色素、藏紅花色素、梔子黃色素、梔子綠色素、辣椒紅色素、甜椒紅色素、辣椒橙色素、南瓜黃色素、沙棘黃、密蒙黃色素、柑橘披黃色素、苜蓿色素、萬壽菊色素、柑橘黃、枸杞色素、銀杏黃色素、苦瓜色素、蒲公英色素等。酮類色素酮類色素主要包括：姜黃色素、姜黃油樹脂、姜黃、姜黃素、郁金色素、郁金香紅色素等。醌類色素醌類色素主要包括：茜草紅色素、紫草紅、紫草色素、紫藍紅色素、紫草素、虎杖色素、鳳仙花紅色素、決明子紅色素等。2.2.2天然色素的性質副作用小，安全性高絕大多數(shù)天然色素來自動物、植物組織。因此無毒副作用，安全性高。天然植物色素大多為花青素類、類胡蘿卜素等，因此天然色素不但是無毒無害的物質，而且還含有很多人體必須的營養(yǎng)物質和微生物物質，例如番茄紅色素，β-胡蘿卜素等。色調比較自然，能較好的模仿天然物的顏色植物色素的著色色調比較自然，既可增加色調，又與天然色澤相近，是一種自然的美。植物色素在植物體中含量較少，分離純化較為困難[27]，其中有的共存物存在時還可能產生異味，因此生產成本較合成色素高。部分天然色素對熱、氧、金屬及pH值等敏感，穩(wěn)定性較差天然色素的種類繁多，性質復雜2.2.3天然色素的結構特點按照化學結構不同可分為四吡咯類色素(如葉綠素)、類胡蘿卜色素(如辣椒紅色素)、花青類色素(如葡萄紅色素)、黃酮類色素(如高粱紅色素)、醌類色素(如紫草色素)、其它類色素(如焦糖色素、姜黃色素、甜菜紅色素等)。四吡咯類色素目前應用于食品著色的四吡咯類色素主要有葉綠素、血紅素、膽紅素和藍藻素[28]。這類色素的基本結構都是由四個吡咯環(huán)的α-碳原子通過次甲基相連而構成的復雜共軛體系，該共軛體系一般與金屬離子(Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+)結合。四吡咯環(huán)共軛，這類色素的性能主要由共體系結合的金屬離子和衍生的外圍結構決定。類胡蘿卜色素系共軛烯烴（或共軛烯烴的含氧衍生物），能有效的防止自由基對脂質內側生物膜的損害，而且還是有效的氧自由基捕獲器[29]。例如：β-胡蘿卜素食維生素A的前體，可提高機體的免疫功能，可防治中風、心血管疾病的作用[30]；番茄紅素可以清除自由基，并能有效預防前列腺癌的發(fā)生，還可以激活免疫細胞，防止心腦血管疾病的發(fā)生；玉米黃色素是單線態(tài)氧，可防止脂質過氧化反應的鏈式傳遞，從而可以清除膜內的自由基，維持生物膜的完整性；梔子黃色素具有抗氧化能力和解熱、消炎、利膽的功效。類黃酮類色素黃酮類色素是帶有C6-C3-C6的水溶性酚類物質，可以切斷體內產生衰老和疾病的過氧化鏈式反應。黃酮類色素還可以保護血管，調節(jié)血管的擴張，防止動脈硬化和栓塞。花色苷類色素花色苷類色素由糖苷和糖組成，一般情況下為水溶性，能強烈的吸收紫外線，使細胞分化和其他生命過程正常進行，還可以預防冠心病和心急缺損等。徐清海[31]《天然色素的提取及其生理功能》中提到：從我國食藥兩用的紫蘇中提取的紫蘇色素，有解毒、散寒、行氣和胃的功效。醌類色素醌類色素因其結構中有多個酚羥基，所以具有一定的抗氧化活性以及抗菌、抗癌、抗病毒的作用。2.3天然色素提取方法2.3.1一般提取法蛹蟲草子實體天然色素的提取一般是采用研磨的方法[32]。通常先用石英砂協(xié)助研磨，再加入丙酮作助磨劑浸提后得到天然色素。由于不同研究者用的提取方法不同，所以蛹蟲草子實體中天然色素的得率也不同。張志軍[33]等人稱取1g蛹蟲草子實體的樣品，加入0.5g石英砂后研磨，并同時加入20mL丙酮作為助磨劑，在研磨15min之后，將所得的混合物直接用于浸提處理。稍后再室溫下振蕩30min，之后經過4000r/min的離心機離心10min，最后取得蛹蟲草子實體中的天然色素提取液。最后經紫外-可見光吸收光譜法測得天然色素的產量為718μg/g。適用范圍：溶于丙酮的色素2.3.2酸熱提取法原理主要是由于酸熱法使用了對細胞壁中原來結構緊密的某些成分(多糖和蛋白質等)具有強力疏松作用的鹽酸，并配合沸水處理及速冷處理，使細胞壁結構得以破壞，胞內物質溶出。特點該法設備簡單、能耗小、成本低適用范圍對熱和pH值不敏感的色素參照郭鵬飛[34]等的方法，每克蛹蟲草子實體的樣品加2mol/L鹽酸10mL，在室溫下浸泡40min，隨后在沸水浴中處理4min，迅速冷卻后，再3000r/min的離心機中離心10min，棄上清液后，將沉淀用蒸餾水洗滌2次后加20mL丙酮，室溫下振蕩30min以浸提蟲草子實體中的天然色素，然后再在4000r/min條件下離心15min，得上清液即為天然色素的浸提液。最后經紫外-可見光吸收光譜法測得天然色素的產量為2736μg/g。2.3.3微波提取法原理微波所產生的電磁場使被萃取的部分向萃取溶劑界面擴散速率加快[35]。例如在用水做溶劑時，在微波場下，水分子高速轉動成為激發(fā)態(tài)，而當水分子本身釋放能量回到激態(tài)時，它所釋放能量傳遞給其它物質分子，加速其熱運動，縮短被萃取分子由物料內部擴散到萃取溶劑界面的時間，從而使萃取速率提高數(shù)倍，同時還降低了萃取溫度，最大限度的保證了萃取質量。特點用微波法提取可以縮短生產時間,降低能源溶劑的消耗,同時可以提高提取物的純度適用范圍對熱穩(wěn)定的色素參照趙大球[36]等的方法，稱取一定量的樣品，之后以丙酮為提取劑，料液比1∶20g/mL，將其混勻后置于微波爐中。在微波功率為140W的提取條件下，提取3min。在微波提取后，于室溫下振蕩30min，經離心機離心后得天然色素的浸提液。最后經紫外-可見光吸收光譜法測得天然色素的產量為696μg/g。2.3.4超聲波提取法原理超聲波提取法[37]利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超聲波的次級效應,如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放，并充分與溶劑混合，利于提?。怀暡ǖ姆鬯?、攪拌等特殊作用，可打破植物細胞壁，以使溶媒盡快滲透到植物細胞中，溶出其中有效成分。特點超聲波法在提取過程產生強烈的振動、空化、攪拌，與傳統(tǒng)提取方法相比具有生產周期短、無需加熱、產率高、條件溫和有效成分不被破壞等優(yōu)點參照姬小明[38]的方法，稱取一定量樣品，以丙酮為提取劑，在料液比為1∶20g/mL的情況下,避光條件下用超聲波提取1h，超聲后在室溫下振蕩30min，最后經離心后，取上清液得天然色素的浸提液。最后經紫外-可見光吸收光譜法測得天然色素的產量為628μg/g2.3.5超臨界CO2萃取法（SFE）原理利用處于臨界溫度、臨界壓力之上的超臨界流體具有溶解許多物質的能力的性質,將其作為萃取劑，從液體或固體中萃取分離出特定成分的新型分離技術[39]。特點無化學溶劑消耗和殘留、無污染,避免了色素在高溫下的熱裂化，保護了色素的天然活性，保持了天然色素的色澤、香氣純正。同時提取工藝簡單，能耗低，萃取劑便宜，提取的產品具有純度高，無毒副作用等優(yōu)點。適用范圍番茄紅素、β-胡蘿卜素、紫草色素、玉米黃色素據(jù)文獻報道[40]，超臨界CO2萃取技術在天然色素萃取中的應用研究主要有番茄紅素、β-胡蘿卜素、紫草色素、玉米黃色素等的提取。如：在40MPa下，得到65%番茄紅素和35%胡蘿卜素;超臨界CO2萃取技術萃取紫草色素含雜質少，色價高，產品色質好，避免了有機溶劑萃取的溶劑殘留問題；在34.47MPa下得到番茄紅素為38.8%的最大提取率；所得玉米黃色素的性能指標優(yōu)于傳統(tǒng)方法，萃取率高且不含殘留溶劑，產品指標符合國家標準等。2.3.6有機溶液提取法原理相似相溶特點萃取劑便宜，設備簡單，操作簡單易行，提取率較高，但用其提取的某些產品質量較差，純度較低，有異味或溶劑殘留，影響產品的應用范圍。適用范圍水溶性、醇溶性的花色苷類、黃酮類、脂溶性色素據(jù)姚成立[41]等的研究報告提出：提取高梁紅色素是用0.1%的鹽酸水溶液浸泡2h，除去雜質和雜色后，再用7%的乙醇水溶液在40℃下浸提，然后過濾、濃縮、干燥而得。利用有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取姜黃得姜黃色素。將蝦殼用鹽酸浸泡24h后過濾，濾渣用95%乙醇浸泡,提取液經蒸餾后得到濃縮的粗制蝦青素提取物。2.3.7酶法提取法原理纖維素酶可是纖維素、半纖維素等物質降解，引起細胞壁和細胞間質結構發(fā)生局部疏松、膨脹等變化，從而增大胞內有效成分向提取介質的擴散，促進色素提取效率的提高。特點條件溫和、有效成分理化性質穩(wěn)定等優(yōu)點適用范圍紅花黃色素2.4蛹蟲草子實體天然色素的測定方法2.4.1紫外-可見光吸收光譜法紫外--可見分光光度法是根據(jù)物質分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結構分析方法[42]。此方法具有靈敏度高、準確度好、選擇性優(yōu)操作簡便、重現(xiàn)性好，分析速度好、應用廣泛等特點。波長長（頻率?。┑墓饩€能量小，波長短（頻率大）的光線能量大。分光光度測量是關于物質分子對不同波長和特定波長處的輻射吸收程度的測量。2.4.2高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法是一種以液體為流動相的現(xiàn)代柱色譜分離分析技術[43]。該技術具有分離效率高、分析速度快、用樣量少、靈敏度高、流出組分可收集,兼具分析和制備等優(yōu)點，適應于高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的化合物分離分析。對于熱不穩(wěn)定性或極性大的天然色素來說，HPLC是一種有效的分離分析方法。趙明波[44]等建立了菊科植物紅花中的主要有效成分羥基紅花黃色素A的HPLC定量分析方法。HPLC技術在天然色素成分分析中的應用研究主要有玉米黃素、β-玉米黃素、葉黃素、番茄紅素、α，β-胡蘿卜素的分析。如：玉米黃素、葉黃素、番茄紅素與β-胡蘿卜素用NovapakC18(4.6mm×150mm)色譜柱，流動相為乙腈-甲醇-二氯甲烷(體積比70:20:10)；β-胡蘿卜素、VE、VD3用正相LPorasil柱，反相VydacTP54柱，流動相為己烷-二異丙醚-10%二異丙醚己烷溶液，梯度甲醇-水(體積比93:7)；玉米黃素，葉黃素，β-玉米黃素，α，β-胡蘿卜素，用C185Lm色譜柱，流動相為乙腈-甲醇-二氯乙烷(體積比60B35B5)，含0.1%BHT、0.1%三乙胺和0.05mol/L醋酸銨；玉米黃素用C18柱，流動相為甲醇-四氫呋喃(體積比95B5)，流速為1.0mL/min。2.4.3薄層色譜法薄層色譜，或稱薄層層析(thin—layerchromatography），是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術[45]。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質的特別有效的層析方法，一般是將固定相(如硅膠)薄薄地均勻涂敷在底板(或棒)上，試樣點在薄層一端，在展開罐內展開，由于各組分在薄層上的移動距離不同，形成互相分離的斑點，測定各斑點的位置及其密度就可以完成對試樣的定性、定量分析的色譜法。薄層層析有許多優(yōu)點[46]：它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘；混合物易分離，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。2.5研究內容及研究意義蛹蟲草作為我國名貴且傳統(tǒng)的強壯滋補品，在歷史上很早就引起了重視和應用。近年來由于國家的重視和商業(yè)經濟的需求，對蛹蟲草的生產、研究和應用取得了迅速發(fā)展。蛹蟲草天然色素作為蛹蟲草子實體中的生理活性物質之一，也是研究的重點。所以，隨著對蛹蟲草子實體中天然色素研究的不斷深入，利用蛹蟲草子實體中天然色素開發(fā)的保健品，功能性食品添加劑和藥品的市場前景為人研究者們所看好。為了研究出有利于人們身體健康的、經濟效益高的蛹蟲草子實體中天然色素的深加工產品，就需要我們廣大的食品科學家、生物學家和醫(yī)學家們的共同努力，從而帶動整個研究的快速發(fā)展。本實驗就蛹蟲草子實體中天然色素的提取進行了進一步的研究，不僅以天然色素的提取產量為目標，還考慮到后續(xù)的處理方面，在盡可能多的提取出蛹蟲草子實體天然色素的基礎上，通過提取方法的優(yōu)化，在提取過程中完成了對天然色素的初級提取分離操作。本實驗為以后進一步研究蛹蟲草子實體天然色素的結構奠定基礎，也進一步為開發(fā)蛹蟲草子實體天然色素產品提供了理論依據(jù)以及廣闊的市場經濟前景，其實驗數(shù)據(jù)及實驗方法也為其他領域的研究提供了平臺和參考。

第三章試驗部分3.1材料與設備3.1.1原材料蛹蟲草子實體，經粉碎后，干燥條件下保存?zhèn)溆谩?.1.2主要儀器（1）YJ1002型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；（2）FQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；（4）721紫外可見分光光度計，上海亞容生化儀器廠；（5）DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；（6）G8023CTL-K3名秀光波微波爐，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；（7）101A型電熱鼓風干燥箱，中國天津泰斯特儀器有限公司；（8）DH6-914385-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；（9）HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠。3.1.3主要試劑甲醇（分析純）丙酮（分析純）鹽酸（分析純）乙醚（分析純）石油醚（分析純）3.2試驗方法3.2.1蛹蟲草子實體中天然色素的提取工藝酸熱浸提法按每克樣品加2mol/L鹽酸10mL，室溫下浸泡40min，在沸水浴中處理4min，迅速冷卻，3000r/min離心10min，棄上清液，將沉淀用蒸餾水洗滌2次后加20mL丙酮，室溫下振蕩30min以浸提天然色素，然后再在4000r/min條件下離心15min，得上清液即為天然色素的浸提液。超聲波法稱取一定量樣品，丙酮為提取劑，料液比1∶20(g/mL)，避光條件下超聲波提取1h，為了保持超聲溫度恒定，采用分段超聲，10min為一個提取階段。超聲后室溫下振蕩30min，離心后取上清液得天然色素的浸提液。微波法稱取一定量樣品，丙酮為提取劑，料液比1∶20（g/mL），混勻后置于微波爐中。在微波功率為140W的提取條件下，提取時間3min。微波提取后，于室溫下振蕩30min，離心得天然色素的浸提液。一般研磨法稱取1g樣品，加入0.5g石英砂研磨，同時加入20mL丙酮作為助磨劑，研磨時間為15min，所得混合物直接用于浸提。室溫下振蕩30min，4000r/min離心10min得天然色素的提取液。3.2.2蛹蟲草子實體中天然色素提取工藝的優(yōu)化（酸熱法）圖3.1天然色素提取工藝單因素試驗（1）鹽酸濃度對蛹蟲草子實體中天然色素提取率的影響分別按每克樣品加0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L鹽酸溶液按照酸熱提取法的提取工藝過程進行實驗，從而確定適宜的鹽酸濃度。（2）鹽酸用量對蛹蟲草子實體中天然色素提取率的影響分別按每克樣品加0.5mol/L的鹽酸溶液5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL，按照酸熱提取法的提取工藝過程進行實驗，從而確定適宜的鹽酸用量。（3）熱處理時間對蛹蟲草子實體中天然色素提取率的影響按照酸熱提取法的提取工藝過程，分別在沸水浴中處理1min、2min、4min、6min、8min、10min，從而確定適宜的熱處理時間。響應面優(yōu)化實驗根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素影響試驗結果，選取鹽酸濃度、鹽酸用量、丙酮浸提時間對天然色素提取影響顯著的3個因素，在單因素試驗基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，因素與水平見表3.1，Box-BehnkenDesign試驗設計表見表3.2。表3.1酸熱法響應面試驗因素水平表因素水平-101鹽酸濃度（mol/L）0.20.51鹽酸用量（mL）51015熱處理時間（min）246表3.2Box-BehnkenDesign試驗設計表試驗號鹽酸濃度（mol/L）鹽酸用量（mL）熱處理時間（min）色素產量(μg/g）10-112110310-140115-110600071-108-1-10900010000110-1-112-101130001401-115-10-116000171013.2.3蛹蟲草菌絲體天然色素的檢測標準曲線的繪制準確稱取β－胡蘿卜素對照品10.0mg置于100mL棕色容量瓶中，加氯仿20mL溶解，繼續(xù)加氯仿至刻度，搖勻。準確量取10.00mL溶液置于100mL棕色容量瓶中加氯仿稀釋至刻度，搖勻。分別吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL溶液置于25mL棕色容量瓶中加氯仿至刻度，以0．00mL為空白，在455nm的波長處測定吸收度。色素的檢測提取色素之后，將提取液適當稀釋，用分光光度計在475nm處測定吸光度。3.2.4蛹蟲草子實體中天然色素的性質研究光照對天然色素穩(wěn)定性的影響將天然色素提取液分別置于陽光直射、室內自然光和避光條件下保存24h、48h、72h，測定吸光度的變化。溫度對天然色素穩(wěn)定性的影響將天然色素提取液分別置于25、60、80、100℃下保存1h、2h、3h、4h，測定吸光度的變化。3.3結果與討論3.3.1β－胡蘿卜素標準曲線的繪制圖3.2β－胡蘿卜素標準曲線圖3.2表示,在455nm處測吸光值，以β－胡蘿卜素濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光值吸光度平均值為縱坐標，得線性回歸方程為Y＝0.1672X+0.0021,相關系數(shù)r=0.9999。結果表明β－胡蘿卜素在0.8μg/mL~4.0μg/mL范圍內，吸收度值與濃度呈良好的線性關系。3.3.2蛹蟲草子實體天然色素提取方法的比較提取方法的選擇由圖3.3可知，酸熱法的提取效果是最好的，其主要原因可能是，酸熱法使用了鹽酸，而鹽酸對細胞壁中某些緊密的結構具有強力疏松作用，在同時經過鹽酸浸泡、沸水加熱的工藝之后，細胞壁的結構被破壞，胞內的物質溶出。酸熱法與研磨法、超聲波法及微波法相比，最顯著的優(yōu)點是設備簡單、成本低、能耗小。圖3.3提取方法的比較浸提溶劑的選擇圖3.4不同浸提溶劑的選擇由圖3.4可知，丙酮的色素提取產量最高，石油醚的色素提取產量最低，分析其原因，丙酮是強極性有機溶劑，比弱極性有機溶劑如乙醚等提取色素產量更高。3.3.3酸熱法提取蛹蟲草子實體中天然色素的單因素分析鹽酸濃度對蛹蟲草子實體中天然色素提取率的影響圖3.5鹽酸濃度對色素產量的影響實驗結果表明（如圖3.5)，鹽酸濃度在0.05～0.06mol/L范圍內，隨著鹽酸濃度的降低，色素產量逐漸增大，0.05mol/L時色素產量最大。鹽酸用量對蛹蟲草子實體中天然色素提取率的影響圖3.6鹽酸用量對色素產量的影響實驗結果表明（如圖3.6），隨著濃度的增大，色素產量逐漸降低，說明鹽酸濃度過大對色素有一定的破壞作用；鹽酸濃度太小，色素產量較低，說明破壁效果不明顯。熱處理時間對蛹蟲草子實體中天然色素提取率的影響圖3.7熱處理時間對色素產量的影響實驗結果表明（如圖3.7），熱處理時間在0～4min時，色素產量逐漸增加，4min時色素產量最大，熱處理時間繼續(xù)增加,色素產量開始降低。3.3.4響應面優(yōu)化酸熱法提取蛹蟲草子實體中的天然色素響應面試驗結果表3.3Box-BehnkenDesign試驗設計結果試驗號鹽酸濃度（mol/L）鹽酸用量（mL）熱處理時間（min）色素產量(μg/g）10-1117432110952310-11009401120805-1105156000274671-108248-1-1050190002746100002745110-1-1149812-1015281300027461401-1156715-10-158916000274717101918采用DesignExpert7.0軟件對表3.3試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯(lián)方程，對酸熱提取法提取蛹蟲草子實體中天然色素的影響因素進行更深入的研究和條件優(yōu)化，并做出響應面圖。多元回歸擬合分析得到天然色素的色素產量與各因素變量的二次方程模型為：色素產量（ug/g）= 2746.00+196.2*A+68.50*B+75.75*C +28.50*A*B-7.50*A*C+67.00*B*C-1504.50*A2-543.50*B2-480.50*C回歸方程方差分析回歸方差分析見表3.4，用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，模型的顯著水平遠遠小于0.05，此時Quadratic回歸方差模型極顯著。從回歸方程各項的方差分析結果還可以看出方程的失擬項較小，表明該方程對試驗擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測。從表3.6還可以看出,對色素產量影響的大小依次為鹽酸濃度、熱處理時間、鹽酸用量。表3.4方差分析表方差來源平方和自由度均方f值p值顯著性模型 1.309 1.4590.37<0.0001A-鹽酸濃度（mol/L） 3.081 3.0819.160.0032**B-鹽酸用量（ml/g）37538.00137538.002.330.1703C-熱處理時間（min）45904.50145904.002.860.1349AB3249.0013249.000.200.6666AC225.001225.000.0140.9092BC17956.00117956.001.120.3257A29.5319.53592.81<0.0001**B21.2411.2477.36<0.0001**C29.7219.7260.470.0001總殘差1.12716077.00失擬誤差1.12337512.3375024.67<0.0001**純誤差2.0040.50總和1.3216注：**.P＜0.01，差異極顯著；*.P＜0.05，差異顯著。響應面曲面分析RSM方法的圖形是特定的響應面(Y)與對應的因素X1、X2、X3構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，每個響應面對其中兩個因素進行分析，另外一個因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對響應值的影響，從試驗所得的響應面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用?；貧w優(yōu)化響應面圖分別見圖3.8。鹽酸濃度與鹽酸用量對天然色素提取率影響的響應面和等高線圖鹽酸濃度與熱處理時間對天然色素提取率影響的響應面和等高線圖鹽酸用量與熱處理時間對天然色素提取率影響的響應面和等高線圖圖3.8圖3.8直觀地反映了各因素對響應值的影響，比較圖中6個圖可知：鹽酸濃度對天然誰說的色素產量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線相對較陡；而鹽酸用量、熱處理時間表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應值變化較小。根據(jù)所得到的模型，可預測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最優(yōu)工藝條件為在室溫條件下，鹽酸濃度0.05mol/L,鹽酸用量10mL，熱處理時間5min。此條件下，天然色素的產量為2747.71μg/g。驗證實驗為了檢驗實驗結果是否與真實情況相一致，根據(jù)上述結果進行近似驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為室溫條件下，鹽酸濃度0.,05mol/L，鹽酸用量10mL，熱處理時間5min,在此條件下進行3次平行實驗天然色素的色素產量為2743.01μg/g。與理論預測值相比，其相對誤差約為0.171%。而且重復性也很好，說明優(yōu)化結果可靠。3.3.5蛹蟲草子實體中天然色素的性質研究光照對天然色素穩(wěn)定性的影響圖3.9光照對天然色素穩(wěn)定性的影響由圖3.9可知，日光對類胡蘿卜素有明顯的破壞作用，而室內自然光及放置在暗處對天然色素的影響相對較小，所以用天然色素著色的食品在儲存和運輸過程中應盡量避免陽光直射，以保持食品色澤。溫度對天然色素穩(wěn)定性的影響圖3.10溫度對天然色素穩(wěn)定性的影響由圖3.10可知，天然色素隨著溫度的升高，降解速度加快，溫度對天然色素有一定的破壞作用。

第四章結論與展望4.1結論(1)本實驗以用蛹蟲草子實體中天然色素的提取率為標準，比較了四種提取方法，其中因酸熱提取法操作簡易，條件易控制，結果精準，提取率最高，成為最適合的提取方法。提取后利用紫外-可見分光光度法檢測天然色素。(2)在單因素試驗的基礎上，經響應面優(yōu)化實驗確定了提取用蟲草子實體中天然色素的最佳工藝條件為：鹽酸濃度0.05mol/L,鹽酸用量10mL，熱處理時間5min,并以丙酮為提取溶劑，用量為10mL。在此條件下，天然色素的提取率為2747.71μg/g。（3）對于天然色素的穩(wěn)定性，日光對天然色素有明顯的破壞作用，溫度升高對天然色素有一定的破壞作用。4.2展望綜合蛹蟲草子實體中天然色素的上述藥理作用，蛹蟲草子實體不僅有抗腫瘤、降血糖、抗衰老、提高免疫力的作用，還能夠抗炎及治療肝的病毒性感染。本實驗取得了一些成果，但仍然有需要提高和完善的地方，比如在檢測方法上，分光光度法檢測蛹蟲草子實體天然色素含量存在一定的缺陷，因此還需要進一步摸索更準確的蛹蟲草子實體天然色素含量測定方法；對于工業(yè)化生產中蛹蟲草子實體天然色素的提純，還需要尋找更經濟的方法和材料等。本實驗來源于社會的需求，在技術上已經具有一定的基礎，隨著人工培養(yǎng)蛹蟲草產業(yè)規(guī)模的不斷擴大，作為培養(yǎng)附屬產物的固體培養(yǎng)基的產出量也會越來越大。因此該研究課題具有良好的開發(fā)價值，其產業(yè)化必然會帶來良好的社會效益和環(huán)境效益。隨著對蛹蟲草子實體天然色素的生物活性研究進一步深入，天然色素的生物活性機理及功效因子將會更加明確，它的應用領域也必將會更加拓寬。但是，由于多天然色素本身的結構很復雜，種類繁多，其結構的測定和分離純化有較大的難度，有些子實體天然色素的藥理作用還與許多其它因素有關，給色素的研究及應用帶來許多挑戰(zhàn)，這需要相關行業(yè)的人士來共同應對。近些年，人們的健康保健意識逐漸增強。天然色素作為保健食品的成分也將會成為人們研究的重點。我國天然色素資源豐富，應用歷史悠久，具有巨大的開發(fā)前景。通過對蛹蟲草子實體天然色素的構效和量效關系的研究，人們將會利用我國豐富的多糖資源，生產出高附加值的保健食品，以提高人民身體素質、增進健康、提高生活質量。

致謝在這里首先要感謝我的導師王志兵老師。王志兵老師平日里工作繁多，但在我做畢業(yè)設計的每個階段，論文從選題、構思、資料收集到最后定稿的各個環(huán)節(jié)給予細心的指引和教導，使我對于蛹蟲草子實體天然色素的提取有了深刻的認識，并最終得以完成畢業(yè)論文。我的設計較為復雜煩瑣，但是王老師仍然細心地糾正論文中的錯誤。除了敬佩王老師的專業(yè)水平外，王老師嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、豐富淵博的知識、敏銳的學術思維、精益求精的工作態(tài)度、積極進取的科研精神以及誨人不倦的師者風范是我畢業(yè)生的學習楷模，并將積極影響我今后的學習和工作。同時也非常感謝給予我支持的邱芳萍老師為我的試驗提供了實驗場所和儀器設備。論文是在長春工業(yè)大學食品功能研究所完成的，在整個設計和實施過程中，學長學姐對論文的開展提出了許多寶貴的意見和建議，使我受益匪淺。其次還要感謝大學四年來所有的老師，為我們打下牢固專業(yè)知識的基礎；同時還要感謝所有的同學們，正是因為有了你們的支持和鼓勵。此次畢業(yè)設計才會順利完成。然后感謝長春工業(yè)大學四年來對我的大力栽培。在四年的大學生涯里，還得到眾多老師的關心支持和幫助，在此謹向老師們致以衷心的感謝和崇高的敬意。最后，我要向在百忙之中抽時間對本文進行審閱、評議和參加本人論文答辯的各位老師表示感謝。參考文獻[1]林群英,宋斌,李泰輝等.蛹蟲草研究進展[J].微生物學通報，2006,33（4）:154-157[2]陳順志.冬蟲夏草和北蟲草研究進展[J].中國生化藥物雜志,1995,5（16）：242-245[3]劉剛.國內蛹蟲草研究現(xiàn)狀[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,1994,1（1）：23-24[4]貢成良，吳衛(wèi)東，徐承智等.家蠶蛹蟲草的化學成份分析[J].蠶業(yè)科學，2002，28（2）：168-172[5]蔡友華,劉學銘.蟲草素的研究與開發(fā)進展[J].中草藥,2007,8（38）：1269-1272[6]丁尚萍,馬力,魏書堂等.蟲草素誘導人肝癌HepG-2細胞凋亡及對端粒酶活性影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2008,2（15）：109-113[7]施英,吳娛明,廖森泰等.蛹蟲草藥理作用研究進展[J].廣東蠶業(yè),40(3)：43-45[8]黎穎.甘露醇的性質、生產與發(fā)展建議[J].廣西化學,1999,4（28）：30-32[9]張建軍,徐洪利,趙斐等.蟲草多糖結構及免疫功能研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2009.37（26）：12542－12544.12594[10]吳曉忠,羅素琴,劉樂樂等.中藥多糖抗腫瘤作用的研究進展[J].內蒙古醫(yī)學院學報,2009,1（31）：81-83[11]李連德,李增智,樊美珍等.蟲草多糖研究進展（綜述）[J].安徽農業(yè)大學學報,2000,27（4）：413-416[12]張欣.超氧化物歧化酶（SOD）及其研究進展[J].內蒙古石油化工,2010,（16）:14-15[13]趙勇.超氧化物歧化酶（SOD）的應用研究進展[J].攀枝花學院學報,2007,6（24）：9-11[14]遲乃玉,張慶芳,劉長江等.SOD的化學特性及其應用[J].沈陽農業(yè)大學學報,1990-04,30（2）：171-175[15]鄧玉清,王紀,虞龍等.微生物麥角甾醇的研究進展[J].微生物學雜志,2001,3（21）：45-47[16]高虹,史德芳,楊德等.巴西菇麥角甾醇抗腫瘤活性及作用機理初探[J].中國食用菌,2011,30（6）：35-39[17]徐廷萬,王麗波,段文健等.人工蛹蟲草胞外多糖對受抑制的免疫功能的影響及抗疲勞作用[J].中藥藥理與臨床,2002，18（6）：17-18[18]戴瑛,張斌,周勇等.蛹蟲草提取物對內毒素引起小鼠急性肺損傷的保護作用[J].研究原著.2004年4月,9（4）：386-388[19]劉海燕,魏本征.柞蠶蛹蟲草對小鼠非特異性免疫功能影響的研究[J]山東中醫(yī)藥大學學報.2004,4（28）：304-305[20]孫科峰,戴兵,劉珂等.人工蛹蟲草子實體對荷瘤小鼠免疫功能的影響[J]中國醫(yī)藥學報.1990[21]湯新強,楊彤,李傳勛等.人工蛹蟲草胞外多糖對卡鉑抗癌和骨髓抑制作用的影響[J].中醫(yī)藥學刊.2004,3（22）：403-406[22]賓文,宋麗艷,于榮敏等.人工培養(yǎng)蛹蟲草多糖的抗炎及免疫作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥.2003,1（14）：1-2[23]陳桂寶,羅梅初,劉實晶等.蛹蟲草的藥理作用研究[J].中草藥.1997,7（28）：415-417[24]陳敬民,李友娣,洪庚辛等.蛹蟲草的鎮(zhèn)靜催眠作用[J]中藥藥理與臨床.1997,13（6）：44-45[25]王琦,梅寧,梅汝鴻.益微超氧化物歧化酶（SOD）研發(fā)歷程[26]趙鵬,楊俊峰,李彬,等.蛹蟲草菌絲體降血脂作用的動物試驗研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2004,16(5):434-436[27]李崇英,王安,李濤等.食用天然色素的純化與研究進展[J].中國調味品.2007,9:19-24[28]左玉.天然色素研究與應用[J].糧食與油脂,2006,9：46-48[29]楊麗華,陳曉光.天然色素的資源開發(fā)和應用研究進展[J].中國食物與營養(yǎng).2010,6：13-16[30]李福枝,劉飛,曾曉希等.天然類胡蘿卜素的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2007,9（28）：227-232[31]徐清海,明霞.天然色素的提取及其生理功能[J].應用化學.2005,5（34）：268-271[32]毛利娟,王永祿,李學明等.共研磨法提高蘭索拉唑的溶出度[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志.2011,42（8）：595-600[33]張志軍,江曉路,牟海津等.蛹蟲草類胡蘿卜素提取工藝的研究[J].食品科技.2006：99-103[34]郭鵬飛,胡長鷹.番木瓜中類胡蘿卜素的提取[J].中國調味品.2009,34（1）：95-99[35]王志祥,李紅娟,萬水昌等.微波萃取技術及其在中藥有效成分提取中的應用[J].時珍國醫(yī)國藥.2007,5（18）：1245-1247[36]趙大球,薛銀芳,周春華等.植物類胡蘿卜素分析方法研究進展[J].北方園藝.2011（02）：195-199[37]鐘玲,尹蓉莉,張仲林等.超聲提取技術在中藥提取中的研究進展[J].西南軍醫(yī).2007,6（9）：84-87[38]姬小明,邵惠芳,劉金霞等.類胡蘿卜素的提取及分離方法研究進展[J].河南科學.2008,11（26）：1337-1339[39]倪志偉,李軍玲.超臨界CO2萃取技術在天然產物提取中的應用[J].安徽農業(yè)科學.2009，36（14）：5715-5716[40]楊忠林,邵友元,姚創(chuàng)等.超臨界CO2萃取技術在天然產物提取中的應用[J].廣東化工.2009,,3（36）：26-29[41]姚成立,畢建洪.天然色素的提取和研究進展[J].安徽化工.2007,3（33）：1-4[42]楊萬政,曹秀君,李金淑等.紫外分光光度法測定沙棘油中總類胡蘿卜素方法改進[J].中央民族大學學報.2009,3（18）：5-8[43]楊虹琦,岳騫,黎娟等.高效液相色譜法測定烤煙類胡蘿卜素[J].湖南農業(yè)大學學報（自然科學版）.2006,6（32）[44]趙明波,鄧秀蘭,王亞玲等.高效液相色譜法測定紅花中的羥基紅花黃色素A[J].色譜.2003,6（21）：593-595[45]彭光華,李忠,張聲華等.薄層色譜法分離鑒定枸杞子中的類胡蘿卜素[J].1998,1（20）：76-78[46]果秀敏,崔彤宇,牛延鋒等.薄層色譜法分離菠菜葉片中色素的研究[J].河北農業(yè)大學學報,2000,2（23）：101-104目錄TOC\o"1-2"\h\z\u第一章總論 11.1項目名稱與承辦單位 11.2研究工作的依據(jù)、內容及范圍 11.3編制原則 31.4項目概況 31.5技術經濟指標 51.6結論 6第二章項目背景及建設必要性 82.1項目背景 82.2建設的必要性 9第三章建設條件 113.1項目區(qū)概況 113.2建設地點選擇 錯誤！未定義書簽。3.3項目建設條件優(yōu)劣勢分析 錯誤！未定義書簽。第四章市場分析與銷售方案 134.1市場分析 134.2營銷策略、方案、模式 14第五章建設方案 155.1建設規(guī)模和產品方案 155.2建設規(guī)劃和布局 155.3運輸 185.4建設標準 185.5公用工程 205.6工藝技術方案 215.7設備方案 215.8節(jié)能減排措施 24第六章環(huán)境影響評價 256.1環(huán)境影響 256.2環(huán)境保護與治理措施 266.3評價與審批 28第七章項目組織與管理 297.1組織機構與職能劃分 29HYP