細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介

關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介第1頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三報(bào)告內(nèi)容一轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介二轉(zhuǎn)染的分類三轉(zhuǎn)染的方法四轉(zhuǎn)染后篩選第2頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)介

1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。

第3頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、轉(zhuǎn)染的分類瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的快速分析為獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的單細(xì)胞克隆目的DNA與宿主染色體未整合整合表達(dá)持續(xù)時(shí)間隨細(xì)胞分裂而稀釋至丟失48－72小時(shí)隨宿主細(xì)胞本身基因組一樣復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，并被穩(wěn)定遺傳

篩選辦法抗生素抗性抗生素抗性第4頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、轉(zhuǎn)染的方法基因轉(zhuǎn)染的基本方法可以分為：（1）重組子的構(gòu)建（2）基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法第5頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三重組子的構(gòu)建1.目的基因的制備和獲取2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇3.DNA片斷的重組連接4.DNA重組體的鑒定第6頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.目的基因的制備和獲取(1)目的基因是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段(2)目的基因常用的制備方法第7頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三A.限制酶切除

a.從原核基因組DNA制備－視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。

b.從真核基因組DNA制備

c.從已克隆的DNA片段制備第8頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三B.

PCR或RT/PCR方法制備目的基因a.獲取已知基因

據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）→設(shè)計(jì)/合成一對(duì)引物→PCR（基因組DNA為模板）/RT-PCR(mRNA為模板)→從組織或細(xì)胞制備目的基因b.

構(gòu)建RT/PCR文庫(kù)法獲取未知基因

據(jù)mRNA末端如polyA尾設(shè)計(jì)共同引物→將所用mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有cDNA，插入適當(dāng)載體→構(gòu)成PCR－cDNA文庫(kù)篩選第9頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三C.計(jì)算機(jī)克?。蠢肎enBank信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。D.化學(xué)合成法制備基因片段－用DNA合成儀，對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。第10頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類：質(zhì)粒型載體和病毒型載體（1）質(zhì)粒型載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。A.典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件:a.啟動(dòng)子b.增強(qiáng)子c.多聚腺苷酸化信號(hào)d.藥物選擇標(biāo)記基e.報(bào)告基因f.表位標(biāo)簽第11頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三B.常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE第12頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三2）病毒型載體病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類載體將來在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。目前應(yīng)用的病毒類型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。

A．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常。第13頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三B.腺病毒載體易于培養(yǎng)、純化，在感染過程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較大的外源基因片段，且腺病毒基因不會(huì)發(fā)生整合，是研究真核基因的良好模型。第14頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.DNA片斷的重組連接粘端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)①單酶單切點(diǎn)防自身環(huán)化，希望定向插入；②雙酶雙切點(diǎn)定向克隆，構(gòu)建表達(dá)載體的最好用此法；③利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。①平端，平端連接；②Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接；③Adaptor銜接目的基因和載體；④同源同聚尾，克隆cDNA的最好方法⑤T載體，PCR產(chǎn)物T/A克隆法連接第15頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.DNA重組體的鑒定外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，我們所需要的基因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒定DNA重組體（1）酶切鑒定是必需的，基于下述:A.限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。

B.同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載體連接同一片段(片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的。

第16頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三C.插入法(單酶單切點(diǎn))或替代法(雙酶雙位點(diǎn))酶切，一般來說用3種限制酶切：①可鑒定載體及②插入片段的大小,方向,切后并電泳分析,以確定是否得到預(yù)期的rDNA。2）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因，可進(jìn)行在序列測(cè)定。（3）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。第17頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染方法化學(xué)轉(zhuǎn)染法物理轉(zhuǎn)染法病毒感染法DEAE一葡聚糖法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒磷酸鈣法電穿孔法腺病毒人工脂質(zhì)體法基因槍法第18頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三(1).DEAE-葡聚糖

是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。第19頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三(2).磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法

由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA。第20頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三（3）.脂質(zhì)體介導(dǎo)法（目前應(yīng)用最廣泛）【原理】：陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑與DNA混合后，形成一種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物，DNA被包在脂質(zhì)體中間，這種脂質(zhì)雙層復(fù)合物可直接加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，脂質(zhì)體粘附到細(xì)胞表面并與細(xì)胞膜融合，DNA被釋放到胞漿中。第21頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三此圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。第22頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三【主要應(yīng)用】:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染【特點(diǎn)】：使用方法簡(jiǎn)單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，很大程度上應(yīng)用受限制。第23頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。

第24頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三此圖為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后熒光蛋白的表達(dá)第25頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三物理方法包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。（1）電穿孔法利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn)。

第26頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三(2）顯微注射法該法雖然費(fèi)力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。（3）基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞。第27頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三

病毒顆粒是一類十分有效的基因釋放系統(tǒng)，因此，它是將外源基因?qū)舜罅考?xì)胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性，操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施。（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（2）腺病毒第28頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三四轉(zhuǎn)染后篩選篩選所選用的抗生素跟轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒上所帶的真核篩選抗性基因有關(guān)的。標(biāo)有neo（實(shí)際上應(yīng)該是neoresistance）的載體，指載有降解新霉素的基因，新霉素作用于原核和真核細(xì)胞，對(duì)兩者都有殺傷作用。用于轉(zhuǎn)染后，穩(wěn)定表達(dá)外源基因細(xì)胞的陽(yáng)性篩選。第29頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三標(biāo)有amp（實(shí)際上應(yīng)該是ampresistance）的載體，指載有降解氨芐青霉素的基因（β－內(nèi)酰胺酶），作用于原核細(xì)胞，只對(duì)敏感菌有作用。用于克隆菌的篩選。最常見的載體上帶有新霉素抗性基因neo，所以篩選的時(shí)候用G418。G418是目前獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)最常用的試劑之一。第30頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三G418是一種氨基糖苷類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素，慶大霉素，卡那霉素相似，通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)原核和真核細(xì)胞等都有毒性，包括細(xì)菌，酵母，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶的氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒性狀。第31頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。目前G418的這一特性已在基因轉(zhuǎn)移，敲除，抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。第32頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三轉(zhuǎn)染是否成功的影響因素很多，如需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型（對(duì)于困難的細(xì)胞系尤其如此），需要被轉(zhuǎn)染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)），轉(zhuǎn)染試劑等。但無論在何種情況下，轉(zhuǎn)染的成功均取決于轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性以及重現(xiàn)性這幾個(gè)要素。第33頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三1細(xì)胞（1）分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞（2）貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞（3）傳代次數(shù)（4）細(xì)胞數(shù)量（融合率）第34頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三2交叉污染如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長(zhǎng)快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個(gè)月過后它們就會(huì)完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。第35頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三3載體DNA一般原則：對(duì)純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。確定維持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在測(cè)定細(xì)胞體系的參數(shù)時(shí)，一定要選用一種已知具有功能的載體做對(duì)照。（1）載體完整性（2）載體制備物第36頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三4組織培養(yǎng)試劑一般原則：優(yōu)化您的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并盡可能減少所用試劑的變更。(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2)胎牛血清(3)添加劑第37頁(yè)，講稿共40頁(yè)，2023年5月2日，星期三5轉(zhuǎn)染方案一般原則：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案；首先從一